小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证

旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用机制及其相关抗冷基因工程的应用。克隆了小桐子肌醇半乳糖苷合成酶家族成员3基因(Jc GS3)的全长c DNA,序列长1 053 bp,包含完整的开放阅读框1 008 bp,编码由335个氨基酸组成的酶蛋白(理论分子量为38 k D、等电点为5.44,含有典型的Dx D基序)。对其相应基因组序列中启动子区域进行分析,鉴定到了TATA框、CAAT框、CRT/DRE低温响应元件以及ABA应答元件等。进一步将其在酵母中表达,发现该基因的表达能够显著提高其重组酵母菌的低温抵抗能力。

黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2克隆与表达调控

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是合成棉子糖系列寡糖(RFOs)的关键酶,在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探究GolS2基因在黄瓜应答非生物胁迫中的作用,本研究采用RT-PCR法从黄瓜中克隆了GolS2基因,其开放阅读框长度为981 bp,编码326个氨基酸,植物GolS2蛋白氨基酸序列一致性很高。进化树中,黄瓜GolS2蛋白与拟南芥GolS2和GolS3蛋白聚在同一分支,亲缘关系最近。盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达,但低温处理显著抑制GolS2基因在采后黄瓜果实中的表达。对其启动子顺式作用元件的分析结果显示,GolS2基因启动子中含有多个与逆境胁迫响应有关的顺式作用元件。在采后黄瓜果实中沉默HHO2和GRP3基因的表达,显著下调GolS2基因表达,表明这两个基因调控GolS2基因表达。本研究结果明确了GolS2基因在不同类型黄瓜组织中应答非生物胁迫的功能存在差异,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因VvGolS2-4的克隆及表达特性分析

为了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性,以抗低温品种左优红组培苗为材料,通过同源克隆技术,获得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全长CDS,对其序列进行了生物信息学分析,同时利用实时定量PCR技术探究了3个基因的组织表达特性和响应逆境因子及相关信号分子的特性。结果显示:3个基因c DNA大小分别为954,978,1 011 bp,分别编码317,325,336个氨基酸序列;3个蛋白分子量分别为36.65,36.97,38.12 k Da;等电点分别为5.12,5.33和5.16,且均在C端含有一个疏水的五肽APXAA;实时荧光定量PCR证明,3个GolSs在葡萄不同组织中表达情况不同,VvGolS2和VvGolS4在叶片中表达量最高,而VvGolS3则在花和卷须中表达量最高;不同逆境因子及逆境信号分子均会影响VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的表达量,其中VvGolS2和VvGolS4基因的表达受盐诱导最明显,VvGolS3基因的表达受低温诱导最明显;另外,胁迫信号分子乙烯、过氧化氢和脱落酸均可诱导VvGolS2基因表达量上升,而VvGolS3基因的表达受脱落酸和乙烯的诱导,乙烯、过氧化氢和硫化氢则均可诱导VvGolS4基因表达量上升。综上推测,3个Vv GolSs均与葡萄抵御逆境胁迫相关,但各自功能可能有所不同。

烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1。NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近。这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础。

拟南芥中低温诱导肌醇半乳糖苷合成酶基因表达作用初探

研究了拟南芥中肌醇半乳糖苷合成酶基因(AtGol-3)在低温条件下表达量的变化。结果表明,AtGol-3基因受到低温胁迫诱导;并且AtGol-3基因在低温诱导晚期大量表达,这与其上游受到低温诱导相关的DREB/CBF和ABRE等转录因子的调控有关。

芝麻肌醇半乳糖苷合成酶基因SiGolS6的克隆及功能分析

【目的】SiGolS6是芝麻肌醇半乳糖苷合成酶家族成员,在植物抗旱过程中可能发挥重要作用。研究SiGolS6在植物干旱胁迫抗性中的功能,以期为芝麻抗旱遗传改良提供理论基础和基因资源。【方法】利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法从芝麻中克隆获得肌醇半乳糖苷合成酶基因SiGolS6。使用InterProScan、ClustalX2和MEGA5.2等生物信息学软件对序列进行分析。通过对转SiGolS6拟南芥材料的表型分析和生理指标测定,研究SiGolS6在植物抗旱性中的功能及作用机理。【结果】克隆获得SiGolS6的全长CDS序列为921 bp,编码306个氨基酸,其蛋白质分子量为35.07 kD,等电点为4.75。序列分析显示SiGolS6蛋白含有糖基转移酶保守结构域(IPR002495),属于糖基转移酶超家族。与其他物种GolS蛋白构建的系统进化树中,SiGolS6与马铃薯中的同源基因相似度较高。利用潮霉素筛选和PCR鉴定,获得6个独立的转基因拟南芥株系;qRT-PCR分析筛选出表达量较高的3个转基因株系(OE-2、OE-3和OE-4)用于后续试验分析,检测发现这三个转基因株系的棉子糖含量显著高于野生型植株。干旱胁迫下,转基因株系萎蔫程度较野生型轻,干旱胁迫28 d和复水恢复生长5 d后,转基因株系的鲜重均显著高于野生型,而正常供水条件下无明显差异;干旱胁迫28 d后复水生长5 d,50%的转基因植株基本恢复,而野生型植株存活率不到10%。干旱胁迫21 d,转基因植株的相对电导率,活性氧积累和相对MDA含量均显著低于野生型,而相对SOD、POD活性则显著高于野生型。【结论】在拟南芥中超量表达芝麻SiGolS6,能够提高植物在干旱胁迫中的耐受性。

大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物胁迫表达分析

【目的】本文探索了大豆肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)基因与非生物胁迫的关系。【方法】通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增编码GolS的基因GmGolS。生物信息学分析预测该基因及编码蛋白的理化性质。构建系统进化树分析GolS蛋白的亲缘进化关系。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在非生物胁迫下的表达模式。【结果】GmGolS基因ORF全长987 bp,编码328个氨基酸,分子量38.03 kDa,等电点5.79。GmGolS蛋白定位于细胞的叶绿体和/或细胞质中,并且与沙冬青AmGolS蛋白的亲缘关系最近。干旱、高盐和低温胁迫均可不同程度的诱导GmGolS基因的表达,且GmGolS对干旱胁迫的响应最为明显。【结论】以上结果表明GmGolS基因在大豆中可响应多种非生物胁迫,为GmGolS在大豆抗逆基因工程育种中的进一步应用提供理论依据。

刺齿报春苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因的鉴定及序列分析

肌醇半乳糖苷合成酶基因与植物光合产物运输、种子耐脱水性、抵御生物与非生物胁迫和自我保护等生理生化过程密切相关。基于刺齿报春苣苔(Primulina spinulosa)转录组测序数据,获得(鉴定)1个肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析结果表明,该基因全长1 347 bp(GenBank登录号为MG521418),开放阅读框(ORF)为1 008 bp,共编码335个氨基酸。进一步基于氨基酸序列的分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku,理论等电点为5.09,为亲水性蛋白,含有1个与糖基转移酶家族蛋白相同的保守结构域;刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因与同科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica,FJ222452)的相似性高达90%,两者在系统进化树上聚为1支。研究结果为进一步研究刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子结构和功能奠定了基础。

抑制糖原合成酶激酶-3β活性减少肝细胞凋亡保护D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的小鼠急性肝衰竭损伤

目的研究细胞信号分子糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)对D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)联合诱导的小鼠急性肝衰竭肝细胞凋亡的影响。方法腹腔注射D-GalN/LPS建立小鼠急性肝衰竭模型。实验动物分为对照组、模型组、SB216763干预组(建模前2 h腹腔注射)。检测血清ALT、AST,TUNEL法测定肝细胞凋亡,免疫荧光染色法及比色法检测Caspase-3活性,Western印迹检测Cleaved Caspase-3蛋白表达。多组样本均数的两两比较采用一步法ANOVA分析。结果 GSK-3β活性升高促进了在小鼠急性肝衰竭的发生和发展:抑制GSK-3β活性可以显著改善肝脏功能,血清ALT、AST水平明显下降。SB216763干预组ALT与AST水平分别为(961.1±356.0)IU/L和(2 709.9±423.9)IU/L,SB216763干预组与模型组相比,Caspase-3活性降低,TUNEL方法检测肝细胞凋亡减少,并且Cleaved Caspase-3的蛋白表达降低。结论在D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝衰竭中,抑制GSK-3β活性可能通过抑制肝细胞凋亡而改善肝损伤。因此,对信号分子GSK-3β活性进行干预有可能为急性肝衰竭的治疗提供一个新的靶点。

两个大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因的原核诱导表达

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉子糖系列寡糖(RFOs)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增获得编码GolS的GmGolS2-1和GmGolS2-3基因。添加酶切位点EcoRⅠ和SalⅠ,将GmGolS2-1和GmGolS2-3分别连入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析诱导浓度和诱导时间对蛋白表达的影响。结果表明:在诱导时间为3h,IPTG浓度为0.1mmol·L^-1时,可获得大量GmGolS2-1和GmGolS2-3的重组蛋白,分子量均大约为40kD。

扬州大学发现黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶可通过促进同化物运输提高耐冷性

低温胁迫下,RFOs可在植物体内积累,起到渗透调节、失水保护或抗氧化等作用。RFOs又是黄瓜等葫芦科植物同化物的主要运输形式;因此,RFOs在这类植物的体内具有双重功能。肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是催化RFOs合成的关键酶,可被各种逆境诱导上调,同时也是黄瓜叶片同化物装载的关键酶。在黄瓜叶片中,GolS在低温等逆境胁迫下的变化机制有待探索。

β-乳香酸-3-O-β-D-半乳糖苷的合成

目的从我国传统中药资源中寻求和开发更好的抗肿瘤药物。方法通过糖化学手段和有机合成方法修饰和改性中药化学成分的结构。结果合成出β-乳香酸-3-O-β-D-半乳糖苷。结论1H-NMR和13C-NMR结构表征。

圣云蓝莓果中锦葵色素-3-半乳糖苷的结构鉴定

采用体积分数60%(pH3.0)的乙醇在恒温水浴(40℃)条件下提取圣云蓝莓花色苷,将所得浓缩液经AB-8大孔树脂纯化,40℃减压浓缩,真空干燥得到紫黑色粉末,再经过制备型高效液相色谱分离获得单体化合物。经紫外光谱、红外光谱、质谱、1H和13C核磁共振、薄层色谱对单体化合物进行结构鉴定,确定此化合物为锦葵色素-3-半乳糖苷。

替格瑞洛联合二丁酰环磷腺苷钙治疗心律失常的疗效及其对血清Gal-3与CD40L水平的影响

目的:探讨替格瑞洛联合二丁酰环磷腺苷钙治疗心律失常的疗效及其对患者血清半乳糖凝集素3(Gal-3)、白细胞分化抗原40配体(CD40L)水平的影响。方法:将104例心律失常患者按照治疗方式不同分为对照组和研究组,每组各52例。对照组患者采用二丁酰环磷腺苷钙治疗;研究组采用替格瑞洛联合二丁酰环磷腺苷钙治疗,两组均治疗2个月。比较两组患者治疗前后心功能[左室射血分数(LVEF)、左室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期直径(LVEDD)]、心肌损伤标志物[心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)]、炎症因子[肿瘤坏死因子ɑ(TNF-ɑ)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素6(IL-6)]、半乳糖凝集素3(Gal-3)、肿瘤坏死因子相关激活蛋白(CD40L)、血管内皮功能[一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)]及临床疗效。结果:治疗后,两组LVEF、NO水平均升高,且研究组高于对照组(P<0.05);两组LVESD、LVEDD、cTnT、CK-MB、NT-proBNP、TNF-ɑ、hs-CRP、IL-6、Gal-3、CD40L、ET-1水平均降低,且研究组低于对照组(P<0.05)。研究组临床疗效高于对照组(P<0.05)。结论:替格瑞洛与二丁酰环磷腺苷钙联合治疗,可改善心律失常患者心功能,减轻心肌损伤程度,提高临床疗效,加速恢复,疗效较显著。

金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的制备方法

目的建立金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷对照品的制备方法。方法结合萃取、聚酰胺柱层析、重结晶等方法对吴茱萸甲醇提取物进行分离纯化,通过MS、1HNMR、13CNMR、HPLC等波谱学方法对其分离产物进行结构鉴定和含量测定。结果该法分离所得金丝桃苷和异鼠李素-3-O-半乳糖苷的纯度分别为99.6%和98.0%。结论该方法简便,产品纯度高,可作为中药药效物质基础研究中的对照品。

大肠癌组织中β-半乳糖苷结合蛋白-3与β-葡萄糖醛酸苷酶表达的意义

目的:通过观察β-半乳糖苷结合蛋白-3(Galectin-3)与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-G)在大肠癌组织中的表达,与大肠癌的生物学特征进行比较,以探讨其临床意义.方法:采用SP免疫组织化学方法检测98例临床新鲜标本,其中包括15例癌旁正常大肠黏膜组织及83例大肠癌组织中galectin-3和β-G的表达情况,并进行两种蛋白的表达相关性分析.结果:Galectin-3和β-G蛋白在浸润程度深、分化程度低及Dukes分期较晚的大肠癌组织中的表达高于浸润程度浅(0.15±0.03 vs 0.16±0.05,P=0.02)、分化程度高(0.15±0.012 vs 0.16±0.03,P=0.03)及Dukes分期较早(0.18±0.06 vs 0.17±0.05)的大肠癌组织(P<0.05);在大肠癌组织中,ga-lectin-3的表达和β-G的表达呈正相关(r=0.628,P<0.01).结论:Galectin-3和β-G的异常表达在大肠癌的发生、发展中起着重要作用,具有一定的诊断价值.

PI3K/Akt-aPKC_(ι/ζ)-Nrf2调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达

目的:观察香烟烟雾提取物(CSE)是否通过磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt-不典型蛋白激酶Cι/ζ(aP-KCι/ζ)-核因子相关因子2(Nrf2)信号通路调控大鼠气道上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-γGCS)表达。方法:用Western blot法检测-γGCS、Nrf2、p-Akt和p-aPKCι/ζ蛋白质,细胞免疫化学法观察-γGCS蛋白质表达,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测-γGCSmRNA,免疫荧光法检测Nrf2蛋白质,流式分析法检测p-Akt阳性细胞率,双酶法测定-γGCS活性,酶循环分析法测定总还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果:暴露CSE 3 h,GSH含量显著升高,Nrf2胞核蛋白质、p-aPKCι/ζ蛋白质、p-Akt蛋白质及其阳性细胞率、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性均显著增强。aPKCι/ζ抑制剂RO813220明显减弱p-aPKCι/ζ蛋白质、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性表达,但增强Nrf2胞浆蛋白质表达,对p-Akt无影响。p-Akt抑制剂LY294002及RO813220+LY294002均降低p-aPKCι/ζ蛋白质、p-Akt蛋白质及阳性细胞率、-γGCS蛋白质及其mRNA和活性表达,增强Nrf2胞浆蛋白质表达。直线相关性分析显示Nrf2与-γGCS、p-Akt及p-aPKCι/ζ呈正相关,p-Akt与Nrf2、p-aPKCι/ζ及-γGCS呈正相关,p-aPKCι/ζ与Nrf2、p-Akt及-γGCS呈正相关(P<0.05)。结论:CSE可能通过PI3K/Akt-aPKCι/-ζNrf2调节-γGCS表达。

甲状腺结节中TPO mRNA表达与Ret、半乳糖苷凝集素3及黏蛋白1表达的相关性研究

目的探讨甲状腺结节性病变中甲状腺过氧化物酶(TPO)mRNA的表达及与Ret、半乳糖苷凝集素3(Gal-3)和黏蛋白1(MUC1)表达的关系。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对55例甲状腺结节组织的TPOmRNA表达进行了定性检查。用光密度扫描仪测定并计算样品的TPO/β-actin比值,代表TPO mRNA丰度的相对含量。采用免疫组织化学(SP)法,同步进行了Ret、Gal-3和MUC1蛋白的检测。结果55例中,恶性肿瘤TPO mRNA的表达率低于良性病变(P<0.05)。有表达的43例TPO RT-PCR产物的光密度值,良性病变组TPO mRNA明显高于恶性病变组(P<0.01)。Ret、Gal-3和MUC1在良恶性病变间的表达差异有显著性(P均为0.000),恶性病变组明显高于良性病变组。TPO mRNA定性、半定量结果与Ret、Gal-3和MUC1的表达呈负相关(P<0.01或P<0.05);Ret、Gal-3、MUC1互为正相关(P<0.01)。结论甲状腺过氧化物酶mRNA在甲状腺结节的高表达可视为良性病变的标记之一,Ret、Gal-3、MUC1在甲状腺癌有较高的表达率,4种标记物的联合检测有助于甲状腺良、恶性结节的鉴别诊断。

β-半乳糖苷结合蛋白-3在胃癌组织中的表达及临床意义

探讨β- 半乳糖苷结合蛋白 3在不同分化程度的胃癌组织中表达及其与胃癌生物学行为的关系。方法 采用 S-P 法,检测β 半乳糖苷结合蛋白-3 在 64 例胃癌组织中的表达情况,并采用HPIAS-2000图像分析软件进行定量分析。结果 64例胃癌中β 半乳糖苷结合蛋白-3阳性表达55例,总阳性率为85.9%,46%表现出核染色。β 半乳糖苷结合蛋白 3 在正常组织中的平均吸光度为0.1497±0.01488,高、中和低分化胃癌组织中平均吸光度分别为0.1713±0.02147、0.1873±0.03130和0.2538±0.12160。β-半乳糖苷结合蛋白-3在不同分化程度的胃癌组织中都强表达,均和正常组织有显著性差异(P<0.001);β- 半乳糖苷结合蛋白 3的阳性表达与胃癌分化程度、以及淋巴结转移有关。结论 β-半乳糖苷结合蛋白-3在胃癌组织中表达率高,与胃癌细胞的转移、浸润、生长和黏附有关,是预测胃癌转移的一个较有价值的指标。

氯化锦葵色素-3-半乳糖苷对TNF-α诱导内皮细胞炎症的抑制作用

目的:研究氯化锦葵色素-3-半乳糖苷对细胞肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor-α,TNF-α)诱导人脐静脉内皮细胞(human vascular umbilical endothelial cells,HUVEC)所产生炎症的抑制作用。方法:设立分组,空白组(二甲基亚砜)、10μg/L TNF-α刺激组、浓度为1、10、50、100μmol/L氯化锦葵色素-3-半乳糖苷+10μg/L TNF-α刺激组,通过酶联免疫吸附剂测定方法检测细胞上清中可溶性细胞间黏附因子(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)蛋白含量的变化;用实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞中ICAM-1 mRNA表达量变化;Western blotting检测ICAM-1及核因子κB抑制蛋白(IκBα)蛋白含量的变化;通过免疫荧光方法测定核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)核异位的变化。结果:氯化锦葵色素-3-半乳糖苷呈浓度依赖性的抑制TNF-α诱导HUVEC相应蛋白表达,同时结果显示抑制作用与NF-κB信号通路有关。结论:氯化锦葵色素-3-半乳糖苷抑制TNF-α诱导HUVEC的炎症反应。一般心血管疾病产生的原因中包括因促炎症因子引起的内皮功能障碍及产生的炎症,氯化锦葵色素-3-半乳糖苷的抗炎症作用为防治心血管疾病提供了一定的理论基础。