双功能脱毒用酿酒酵母的构建

饲料中真菌毒素污染普遍,已经成为目前阻碍畜禽健康养殖的一大重要因素。真菌毒素种类繁多,其中黄曲霉毒素,尤其是黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)影响范围广、危害大,开发新方法用于饲料真菌毒素的脱毒是目前的研究热点。本研究分离并比较了4株不同的酿酒酵母菌株对AFB1的吸附能力,发现较其他方式(加热和甘露聚糖酶处理)和菌株,经葡聚糖酶处理后的酿酒酵母CEN.PK菌株对AFB1吸附率最高,可达53.3%±8.2%。随后,再以该菌株为宿主菌组成型表达来自于约氏黄杆菌的肌醇氧化酶基因FjMiox,经改造后工程菌可将1 g·L^(-1)的肌醇全细胞转化为0.273 g·L^(-1)的葡萄糖醛酸。在动物肝脏内,葡萄糖醛酸可经酶催化和真菌毒素结合增强其水溶性使其易于排除,因此可合成葡萄糖醛酸的工程化酿酒酵母结合了肠道内吸附脱毒和肝脏内结合解毒2种功能,为解决黄曲霉毒素在饲料中的污染提供了新的可能解决方案。

生物催化肌醇生产葡萄糖醛酸转化体系的构建与优化

葡萄糖醛酸(D-glucuronic Acid),由于其良好的解毒性能,广泛应用于医药、保健、食品及医美领域。随着合成生物学的高速发展,利用工程菌生产葡醛酸的生物发酵法取代化学合成成为一种趋势。研究结果表明:最佳诱导条件为在OD_(600)为0.5时,培养基中加入0.2 mmol/L的IPTG,26℃诱导8 h,构建的重组菌株BL21/pETDuet-miox可以实现肌醇氧化酶(MIOX)的高效表达;然后将肌醇氧化酶载体质粒pETDuet-miox转化进不同的表达宿主中,根据转化产量最佳表达宿主为Escherichia coli Rosetta(DE3);以肌醇氧化酶作为催化剂催化肌醇生产葡萄糖醛酸的最佳催化形式为冷冻破壁后菌体;得出最佳催化条件为在pH值为7.5的MOPS缓冲体系中,催化温度30℃时,对菌体添加量选择100 g/L湿菌体,底物质量浓度选定2 g/L。在此条件下肌醇转化率80.3%,葡醛酸产量达到1.606 g/L。本项研究为葡萄糖醛酸生物合成提供新的方法,也为葡醛酸的低成本工业化生产奠定基础。

重组大肠杆菌高效催化肌醇合成葡萄糖醛酸的研究

葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域都有广泛的应用。该研究利用重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX)催化肌醇生成葡萄糖醛酸。首先对重组大肠杆菌培养条件进行优化以达到肌醇氧化酶高效表达的目标,以MBL作为发酵培养基,在对数生长期中期(OD600=5.5)加入0.1 mmol/L IPTG,27℃下诱导6 h,肌醇氧化酶的酶活达到100.5 kU/L。然后利用重组菌菌体作为催化剂转化肌醇生产葡萄糖醛酸,以2 g/L肌醇为底物,30℃下反应2 h,葡萄糖醛酸的产量达到1.7g/L,肌醇的转化率为84%。在此基础上,进一步考察了多次添加新鲜菌体对葡萄糖醛酸合成的影响,当肌醇浓度为50 g/L时,经过3次添加菌体葡萄糖醛酸的最终产量达到15.7 g/L。该研究为生物法生产葡萄糖醛酸打下了坚实的基础。