甘蔗磷脂酰肌醇转运蛋白基因ScSEC14响应干旱和盐胁迫

Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins,PITPs),广泛存在于真核生物细胞中,参与肌醇磷酸代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫等多种重要的生命过程。甘蔗中响应干旱和盐胁迫的Sec14-like基因尚未见报道。本研究从甘蔗受黑穗病胁迫的转录组数据库中获得一条SEC14基因序列,并利用RT-PCR技术克隆得到甘蔗SEC14基因c DNA全长序列,命名为Sc SEC14(Gen Bank登录号为MG571103)。生物信息学分析显示,Sc SEC14基因全长1617 bp,包含一个1008 bp的完整开放阅读框,编码335个氨基酸;Sc SEC14为不稳定的亲水性蛋白,不存在信号肽;蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有典型的SEC14结构域和CRAL_TRIO_N结构域。此外,系统进化树分析揭示,该蛋白属于Sec14-like蛋白家族的SSH(soybean Sec14 homolog group)亚家族。亚细胞定位结果表明,Sc SEC14蛋白主要定位于细胞膜。实时荧光定量PCR分析发现,Sc SEC14基因在甘蔗中组成型表达,在蔗皮中的表达量最低,蔗叶中的表达量最高,约为蔗皮的4.9倍;该基因在PEG、Na Cl、CaCl_2和水杨酸(SA)胁迫下的表达量均上调。因此,甘蔗Sc SEC14基因可能参与Ca^(2+)和SA介导的抗逆信号通路,积极响应逆境胁迫,尤其调节了干旱和高盐环境下的抗逆性。

磷脂酰肌醇转运蛋白家族各亚型在动物中的生物功能

脂质是生物膜的主要组成部分,在信号转导和膜运输方面发挥重要的作用。脂质之所以能够在细胞器之间进行转运,是因为它们不但能够以囊泡出芽的方式进行转运,而且还可通过蛋白的作用进行转运。磷脂酰肌醇转运蛋白(PITP)家族就是一类可结合并促进磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱及其他脂质在细胞内膜系统间相互转运的蛋白质。剔除体内特异性PITP亚型会产生广泛的生物效应(如神经突增生、膜运输、细胞分裂和视觉转导等)。

磷脂酰肌醇转运蛋白细胞质1在肝细胞癌中表达及临床意义

背景和目的:肝细胞癌(HCC)侵袭性强,极易发生复发转移,临床预后差。目前HCC发生发展分子机制仍然不清楚。磷脂酰肌醇转运蛋白细胞质1(PITPNC1)是一种脂质代谢相关基因,表现出促癌作用。然而,PITPNC1是否在HCC发展中发挥作用仍然未知。因此,本研究探讨PITPNC1在HCC中的表达及其作用。方法:招募2015年1月—2018年12月间中南大学湘雅医院行肝切除手术的HCC患者116例进行前瞻性队列研究,收集患者的病历资料和组织标本,并进行规律随访。通过免疫组化方法检测患者组织标本PITPNC1蛋白的表达,分析PITPNC1表达和临床病理特征预后之间的关系。通过LCCLD数据库分析PITPNC1在人HCC细胞系中的表达,利用慢病毒包装小RNA干扰PITPNC1在高侵袭转移性HCC细胞系MHCC97H中表达,利用集落形成和皮下成瘤实验观察PITPNC1表达与HCC生长的关系,并对皮下移植瘤行油红O染色。利用生物信息学方法分析PITPNC1作用的分子机制。结果:PITPNC1蛋白阳性染色定位于细胞浆,在癌组织阳性表达率为76.7%(88/116),在癌旁组织阳性表达率为21.5%(24/116),差异有统计学意义(P<0.001)。PITPNC1高表达与卫星结节(P=0.041)、血管侵犯(P<0.001)、肿瘤分化(P=0.027)、BCLC分期(P=0.009)、TNM分期(P=0.028)明显有关。Kaplan-Meier生存分析表明,PITPNC1高表达HCC患者总体生存(OS)率与无复发生存(RFS)率均明显降低(均P<0.001);PITPNC1表达是OS率与RFS率的独立影响因素(HR=11.775,95%CI=1.462~4.082,P=0.006;HR=1.928,95%CI=1.306~4.889,P=0.004)。PITPNC1沉默后,MHCC97H细胞体内和体外生长均明显抑制(均P<0.05)。油红O染色显示,PITPNC1表达下调后,皮下移植瘤的脂质积累明显减少(P<0.05)。数据库分析结果显示,PITPNC1过表达涉及脂质代谢相关的PPAR信号通路活性。结论:PITPNC1是HCC新的癌基因和不良预后标志物。PITPNC1可能通过调控脂质代谢途径而在促进HCC生长过程中可能起重要作用。

禾谷镰刀菌中磷脂酰肌醇转运蛋白功能分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(phosphatidylinositol transfer protein,PITP)保守存在于真核生物中,负责膜系统中磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的转运,参与胞内的脂类信号调控过程。由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁粮食产量和食品安全,而在禾谷镰刀菌的研究中发现磷脂信号网络中的关键元件参与病原菌致病过程的调控。我们利用基因敲除的方法对禾谷镰刀菌中PITP家族的功能进行分析,在禾谷镰刀菌中鉴定了7个PITP蛋白的编码基因,并成功获得了其单敲除突变体。通过表型分析发现,这7个基因的单敲除突变体在营养生长、无性及有性生殖和致病性方面与野生型菌株并无明显差异。研究结果表明:1)禾谷镰刀菌中的PITP基因并不是看家基因;2)不同PITP基因之间可能存在功能冗余;3)丝状真菌中PITP的生理功能与酵母中的PITP存在显著差异。

与低温相关的甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因的克隆及表达分析

真核细胞内膜系统间存在的磷脂酰肌醇转运蛋白PITP(phosphatidylinositol transfer proteins,PITP),能提高植物对逆境胁迫的耐受程度。本研究从甜菜(Beta vulgaris)基因组中分析获得甜菜PITP基因28个,通过低温胁迫,以RT-qPCR筛选出4个与低温胁迫相关最为显著的PITP基因,将其从甜菜中克隆出来,分别命名为Bvsec14、Bvsfh8、Bvsfh11和Bvpate4.2,基因长度分别为776、1401、1519、1604 bp,均具有PITP基因家族所特有的SEC14保守结构域,分别定位在5号、9号、1号和8号染色体上。生物信息学分析结果显示,亚细胞定位预测表明其在细胞膜或细胞质上;4个基因编码蛋白都以无规则卷曲和α-螺旋为主,存在很多的磷酸化位点,以丝氨酸磷酸化数量最多;根据与其他物种的PITP的高度保守的SEC14区域比对,建立的4个基因的进化树表明,其与藜麦(Chenopodium quinoa)的亲缘关系最近;将拟南芥(Arabidopsis thaliana)中PITP蛋白与甜菜中与低温胁迫相关的PITP蛋白进行同源性分析,共分为4个亚组;4个基因编码蛋白之间没有直接互作关系且氨基酸序列间差异较大。以低温胁迫和RT-qPCR进行表达分析,结果表明,4个基因在表达量上无组织特异性,Bvsfh11、Bvsfh8、Bvpate4.2和Bvsec14受低温胁迫后的24 h之内都会出现过量表达,峰值出现在2 h和12 h,且峰值的表达量最低为对照组初始量的1.8倍,最高为25倍。上述结果表明,4个基因参与甜菜低温胁迫应答。本研究为研发新的甜菜抗性品种以及进一步探究PITP功能提供科学理论依据。

酿酒酵母肌醇转运蛋白突变体的构建及其在葡萄糖二酸合成中的应用

【背景】酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)自身具有高亲和力的肌醇转运蛋白Itr1,前期构建的酿酒酵母工程菌在合成葡萄糖二酸时可通过Itr1蛋白对外源肌醇进行转运。但肌醇会诱导Itr1蛋白的降解,因此对外源肌醇的低转运效率限制了葡萄糖二酸产量的进一步提高。【目的】研究肌醇转运蛋白Itr1的N端和C端潜在的泛素化位点-赖氨酸残基突变对该蛋白降解的影响,并进一步分析这些突变体对酿酒酵母细胞摄取胞外肌醇的能力和葡萄糖二酸生物合成的影响。【方法】使用融合PCR方法将不同基因元件进行融合,得到用于基因组整合的片段。再通过同源重组在酿酒酵母基因组上整合这些片段,分别构建含Itr1突变体、含Itr1和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合蛋白的工程菌。通过荧光显微镜观察确定融合蛋白的膜定位情况,高效液相色谱(HPLC)方法检测葡萄糖二酸的合成情况,转录组测序和实时荧光定量PCR方法检测胞内基因转录水平的变化。【结果】发现了C端突变对Itr1蛋白降解具有明显的弱化作用,在发酵条件下,N端突变菌株中Itr1蛋白膜定位完整的细胞比例在短期内也有所增加。摇瓶发酵过程中N端突变菌株的葡萄糖二酸产量和菌体生物量较对照菌株都明显提高。进一步发现N端突变菌株中基因ino1、inm1被上调,pis1的表达被下调,提高了胞内肌醇的积累并促进了肌醇流向葡萄糖二酸合成的代谢流。在此基础上,进一步进行发酵条件优化,葡萄糖二酸产量达到3.30 g/L,较对照菌株提高了95.3%。【结论】本研究确定了C端突变对肌醇转运蛋白Itr1降解的弱化作用,并发现N端突变可以促进葡萄糖二酸产量的提高,为深入研究肌醇利用及进一步提高葡萄糖二酸产量奠定了理论基础。

青海湖裸鲤SMIT1和SMIT2基因克隆及其对碱度环境的应答

【目的】哺乳动物钠/肌醇共转运蛋白(sodium/myo-inositol cotransporter, SMIT)有2个同源体,分别是SMIT1和SMIT2,属于溶质载体(SLC)超家族。试验旨在探究青海湖裸鲤SMIT1、SMIT2基因对碱度环境的应答,为后续SMIT1和SMIT2基因在碱度环境下参与肌醇转运的分子机制奠定基础。【方法】利用PCR技术扩增、克隆SMIT1、SMIT2基因CDS区,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术检测SMIT1和SMIT2基因在淡水环境下青海湖裸鲤鳃、肾脏、脑等8个组织中的表达情况,以及不同碱度胁迫(0、J25、J50、J75、J100)下鳃和肾脏组织中2个基因表达的规律;利用气相色谱质谱法(GC-MS)检测不同碱度胁迫下鳃和肾脏组织中的肌醇含量变化。【结果】SMIT1基因CDS区为2 130 bp,共编码709个氨基酸,其氨基酸序列与犀角金线鲃相似性最高(86.5%),与多鳞白甲鱼亲缘关系最近;SMIT2基因CDS区为2 016 bp,共编码671个氨基酸,其氨基酸序列与多鳞白甲鱼的相似性最高(90.3%),与犀角金线鲃、多鳞白甲鱼的亲缘关系较近。SMIT1和SMIT2均属于溶质体超家族的SLC5家族成员,其中SMIT1蛋白包含2个SLC家族保守结构域。实时荧光定量PCR结果显示,淡水环境下SMIT1和SMIT2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,其中,SMIT1基因在脑和肾脏中表达量较高,SMIT2基因在肾脏中表达量最高,均显著高于其他组织(P<0.05)。随着碱度的升高,与对照组相比,J25、J50、J100时SMIT1基因在青海湖裸鲤鳃中表达量均显著升高(P<0.05),在肾脏中整体表达量均显著升高(P<0.05);J25时SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃中表达量显著升高(P<0.05),J50、J75、J100时在肾脏中表达量均显著降低(P<0.05)。GC-MS结果显示,随着碱度的升高,青海湖裸鲤鳃中肌醇含量均显著高于对照组(P<0.05);肾脏中肌醇含量与对照组相比无显著变化(P>0.05)。【结论】SMIT1、SMIT2基因CDS区分别长2 130和2 016 bp,分别编码709和671个氨基酸,SMIT1基因在青海湖裸鲤脑组织中高表达,而SMIT2基因在青海湖裸鲤肾脏中高表达。不同碱度胁迫下SMIT1、SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃、肾脏中的表达规律不同;肌醇含量在鳃组织中显著升高,且在J50时达到最高,在肾脏中变化不显著。研究结果为进一步探究青海湖裸鲤适应碱度环境的分子机制提供参考依据。

微囊化对HepG2细胞渗透压调节基因表达影响及调控研究

探讨微囊微环境对HepG2细胞渗透压调节基因表达影响及抗渗透压物质干预效果。静电液滴法制备微囊化细胞,Real-time PCR法检测不同培养方式下钠/肌醇转运蛋白(SMIT)和牛磺酸转运蛋白(TAUT)基因表达;通过MTT法检测细胞活性、ELISA法检测白蛋白含量,比较牛磺酸和海藻糖干预后指标变化。结果表明,不同培养方式间SMIT表达无显著差异;微囊化细胞TAUT表达增高,是平面细胞4.3倍(P<0.01);添加1～1.5 mM牛磺酸后,囊内细胞活性较对照组增加约15%～30%,白蛋白水平增加15%(P<0.05);海藻糖虽在0.1 mM时使囊内细胞活性增加20%～30%(P<0.05),但对白蛋白分泌水平无显著影响。微囊内存在高渗应激因素诱导基因表达改变,牛磺酸和海藻糖能拮抗其对细胞的抑制作用。

急、慢性运动对2型糖尿病大鼠脂肪PI3K/AKT/GLUT4通路的影响

目的:探讨急性和慢性运动对2型糖尿病(T2DM)大鼠脂肪组织明磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/葡萄糖运载体4(GLUT4)信号通路的影响。方法:15月龄SD雄性大鼠52只随机分为正常对照组(n=13)和高脂组(n=39),分别喂养普通和高脂饲料。8周后,高脂组体重>正常对照组20%,注射小剂量STZ后,血糖>16.7 mmol/l,造模成功。将糖尿病模型组随机分为糖尿病对照组(DC,n=13),糖尿病慢性运动组(DCE,n=13),糖尿病急性运动组(DAE,n=13)。DCE组进行8周的游泳运动,DAE组进行一次性游泳运动。测定血脂,血糖和血清胰岛素,Western blot法测定脂肪PI3K、AKT和GLUT4蛋白含量。结果:糖尿病组体重、血脂、血糖、胰岛素显著高于正常对照组(P均<0.01);高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低(P<0.05),脂肪组织中PI3K、AKT和GLUT4蛋白表达下降(P均<0.01)。糖尿病慢性运动组体重、血脂、血糖、胰岛素均出现显著性下降(P均<0.01);HDL-C升高(P<0.05),脂肪PI3K、AKT和GLUT4蛋白表达上升(P<0.01)。糖尿病急性运动组血脂、血糖、胰岛素下降(P均<0.05);HDL-C升高(P<0.05),脂肪PI3K、AKT和GLUT4含量显著上升(P均<0.05)。结论:①高脂饮食结合小剂量STZ诱导的T2DM大鼠脂肪组织PI3K/AKT通路受损,降低了胰岛素的敏感性。②急性、慢性有氧运动,均可以通过PI3K/AKT通路,改善糖脂代谢紊乱,慢性运动略优于急性运动。

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为“最具价值的生物炼制产品之一”。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1三种策略对葡萄糖二酸产量的影响。研究结果显示,过量表达肌醇转运蛋白Itr1使葡萄糖二酸产量在摇瓶发酵条件下较出发菌株Bga-3提高了26%;MIOX4-Udh融合蛋白的表达使葡萄糖二酸的产量较Bga-3菌株提高了40%;在此基础上,弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1后,葡萄糖二酸的产量达5.5 g/L,较相同发酵条件下Bga-3菌株提高了60%。在5 L发酵罐中,该菌株葡萄糖二酸的最高产量达10.85 g/L,较Bga-3菌株提高了80%。由此可见,上述代谢改造策略的应用在很大程度上提高了葡萄糖二酸的途径效率和产量,为通过代谢工程方法在酿酒酵母中合成其他化合物的研究提供了参考。

Rpfan37在刺槐共生结瘤过程中的功能探究

目的：研究刺槐中与磷脂酰肌醇转运蛋白有较高同源性的基因Rpfan37的功能,为探究相关基因参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程提供新的思路。方法：通过前期研究,建立豆科植物刺槐与共生根瘤菌互作的抑制差减杂交反交文库,筛选疑似与共生结瘤相关的基因。利用PCR技术快速克隆经实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）分析基因在不同接菌时间及不同植物组织的表达。构建RNA干扰（RNAi）重组载体,转农杆菌介导转化植物根部,接种根瘤菌后验证该基因在刺槐共生结瘤过程的功能。结果：基因表达分析显示,在接菌与未接菌的刺槐根中,处理后第15天,Rpfan37表达均显著上调,但接菌与未接菌处理对该基因表达无显著影响;在成熟的根瘤中,该基因仅为低水平表达。RNAi转化植株的鲜重、株高、根长及结瘤数较对照组显著降低。在显微镜下观察到RNAi植株根毛发育异常;与对照相比,RNAi转化植株形成的根毛卷曲、根毛侵染线及根瘤原基数目均显著降低。根瘤石蜡切片结果显示RNAi植株根瘤中的侵染细胞与对照相比明显减少,分析豆血红蛋白表达发现,RNAi植株中根瘤发育成熟过程明显受阻。结论：在豆科植物刺槐中发现的相关基因Rpfan37能够参与刺槐共生结瘤过程,为研究磷脂酰肌醇转运蛋白在共生结瘤过程中的作用提供了新的理论基础。