内质网应激通路需肌醇酶1α/X盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用

目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)预处理,或分别转染需肌醇酶1α(inositol-requiring kinase 1α,IRE-1α)小干扰RNA(siRNA)、X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1,XBP-1)siRNA,再予以NE刺激;同时设单纯NE组和空白对照组。试剂盒检测ROS的生成水平;Westernblotting检测干预后ERS相关信号分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,pPERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、磷酸化IRE-1α(pIRE-1α)及XBP-1蛋白表达量的变化;实时荧光定量PCR检测剪切的XBP-1(XBP-1s)mRNA水平;ELISA和免疫荧光检测MUC5AC在各组细胞中的蛋白表达情况。结果·与空白对照组相比,NE刺激24 h后细胞ROS含量增加,GRP78、ATF6、pPERK及pIRE-1α蛋白水平均显著升高(均P<0.05),XBP-1s mRNA及蛋白表达也明显增加(均P<0.05),同时MUC5AC蛋白表达增加(均P<0.05);NAC及4-PBA预处理后均使上述ERS相关蛋白表达较单纯NE组降低(均P<0.05),MUC5AC蛋白水平降低(均P<0.05);转染IRE-1αsiRNA或XBP-1 siRNA,细胞中MUC5AC蛋白表达也较单纯NE组明显降低,同时XBP-1s mRNA及蛋白表达也有明显下降(均P<0.05)。结论·NE通过产生ROS引起ERS反应,诱导MUC5AC蛋白表达及分泌增加,ERS通路IRE-1α/XBP-1在其中发挥着一定的作用。

小鼠肺爆震伤后不同时间点超氧化物歧化酶-1、丙二醛-5及肌醇酶-α表达变化研究

目的探讨小鼠肺爆震伤后不同时间点超氧化物歧化酶(SOD)-1、丙二醛(MDA)-5及肌醇酶(IRE)-α表达的变化。方法将64只小鼠分为空白对照组(8只)与爆震伤实验组(56只)。爆震伤模型建立后,分别于3、6、12、24、48 h与1、2周7个时间点解剖8只小鼠。观察每个时间点小鼠的呼吸与被毛状态等,应用RT-PCR与Western-blot检测小鼠肺组织SOD-1、MDA-5及IRE-α在基因与蛋白水平上的表达量。结果爆震伤后,小鼠肺组织SOD-1表达在3 h后开始降低,1周后上升;MDA-5表达在3 h后开始上升,12 h时达到最高,24 h后下降,1周后再次上升;IRE-α表达在3 h后开始上升,24 h时达到最高,48 h后下降,2周时恢复正常。结论小鼠肺组织在发生爆震伤3 h后开始出现氧化应激反应,12~48 h时氧化应激反应达到高峰,随后下降,到2周时基本恢复正常。

结肠癌转移相关基因1、磷酸化需肌醇酶1蛋白在鼻咽癌组织中表达及与其临床病理特征、放疗敏感度及预后的关系

目的探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)、磷酸化需肌醇酶1(p-IRE1)蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况及与鼻咽癌临床病理特征、放疗敏感度及预后的关系,为寻求个体化治疗提供依据。方法选取2016年1月至2018年12月在南阳市中心医院行根治性调强放疗的鼻咽癌病人癌组织标本62例为鼻咽癌组,同时选取同期20例健康人鼻咽部黏膜组织标本作为正常对照组,应用免疫组化法分别检测组织中MACC1、p-IRE1蛋白的表达情况,分析其与鼻咽癌病人临床病理特征、放疗敏感度及预后的关系,以及鼻咽癌组织中MACC1、p-IRE1蛋白阳性表达的相关性。结果鼻咽癌组织标本MACC1、p-IRE1蛋白阳性表达率均明显高于正常鼻咽部黏膜组织标本,均差异有统计学意义(70.97%比15.00%,66.13%比10.00%,P<0.05)。鼻咽癌组织MACC1、p-IRE1蛋白阳性表达与TNM临床分期和分化程度密切相关(P<0.05),鼻咽癌组织MACC1、p-IRE1蛋白阳性表达者放疗敏感度均明显低于阴性表达者,差异有统计学意义(P<0.05)。鼻咽癌组织MACC1及p-IRE1蛋白阳性表达呈显著正相关(χ^(2)=12.18,P<0.001,列联系数=0.405)。放疗后随访期间有12例(19.35%)出现局部复发,14例(22.58%)出现远处转移;死亡24例(38.71%),均死于局部复发或远处转移。鼻咽癌病人放疗后死亡与TNM临床分期、分化程度及鼻咽癌组织MACC1、p-IRE1蛋白表达情况密切相关(P<0.05)。多因素COX回归分析结果显示,TNM临床分期、鼻咽癌组织MACC1、p-IRE1蛋白阳性表达是鼻咽癌病人放疗后死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论鼻咽癌病人MACC1及p-IRE1蛋白检测可能有助于鼻咽癌病人临床分期、病理分化程度以及放疗敏感度的判断,其阳性表达是鼻咽癌预后的独立危险因素,可能成为鼻咽癌基因治疗的新靶点。

需肌醇酶1α及受其调控的依赖性衰减(IRE1α-RIDD)在免疫调节及自身免疫性疾病中的研究进展

内质网(ER)是蛋白质合成、折叠和修饰以及脂质合成和钙离子储存的重要细胞器。ER功能失调导致错误折叠或未折叠蛋白质在ER管腔中的积累,触发未折叠蛋白反应(UPR),需肌醇酶1α(IRE1α)是UPR分支中最保守的信号通路,切割编码转录因子XBP1的mRNA,导致XBP1剪接和激活。IRE1还通过受调控的IRE1依赖性衰减(RIDD)切割相关的mRNA或微小RNA(miRNA)。已有研究证明IRE1α-RIDD途径与免疫反应相关,但其信号级联与免疫协调的机制仍然不清楚,我们总结了IRE1α-RIDD对免疫细胞分化、成熟和免疫反应中细胞因子的表达等在免疫反应中的作用以及参与自身免疫性疾病的分子机制。

需肌醇酶1(IRE1)激活NLRP3炎性体在动脉粥样硬化中的作用

动脉粥样硬化(AS)是缺血性心脑血管疾病的主要病理基础,炎症反应在疾病进程中发挥重要影响。内质网应激(ERS)下游传感蛋白需肌醇酶1(IRE1)可以通过多条途径激活含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)炎性体,二者与AS发生发展关系密切。涉及相关信号通路的关键蛋白p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、核因子κB(NF-κB)、X盒结合蛋白1(XBP1)、NADPH氧化酶(NOX)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)等与AS之间均有关联,提示ERS刺激下IRE1参与活化NLRP3炎性体是AS的可能发病机制。我们总结了IRE1激活NLRP3炎性体的分子机制及相关信号通路的节点蛋白在AS中的作用,以期为研究AS发病机制和防治策略提供新思路。

结肠癌转移相关基因1、磷酸化需肌醇酶1蛋白在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中的表达及其与临床分期的关系

目的:探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)、磷酸化需肌醇酶1蛋白(p-IRE1)在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中的表达及其与临床分期的关系。方法:选取80例鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者作为研究对象,所有患者均行外科手术治疗,在手术过程中取患者鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织进行病理诊断,依照不同分期将所有患者分为四组,即T_(1)组(n=18),T_(2)组(n=23),T_(3)组(n=25)和T_(4)组(n=14),另选取20例同期体检的健康志愿者鼻腔黏膜组织作为对照组。对比五组受检者鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织和鼻腔黏膜组织MACC1和p-IRE1表达水平,并分析鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床分期与MACC1和p-IRE1的相关性。随后对所有鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者进行3年随访,将患者分为预后良好组(n=56)和预后不良组(n=24),对比两组患者临床一般情况与MACC1和p-IRE1表达水平,并应用Logistic回归分析鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中MACC1和p-IRE1表达对患者的预后预测价值。结果:不同临床分期患者MACC1和p-IRE1组织表达水平对比差异有统计学意义(均P>0.05),T_(4)组明显高于T_(3)组、T_(2)组、T_(1)组和对照组(均P<0.05);Spearman相关分析结果显示MACC1和p-IRE1与鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床分期呈正相关(r=0.423、0.539,均P<0.05);预后良好组与预后不良组患者性别、年龄、是否初发情况对比无统计学差异(均P>0.05),两组患者临床分期、组织分化程度、MACC1和p-IRE1阳性情况对比有统计学差异(均P<0.05);Logistic回归分析表明:MACC1和p-IRE1为鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤的预后独立因素(均P<0.05)。结论:鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中MACC1和p-IRE1阳性表达率明显高于健康鼻腔黏膜组织,且MACC1和p-IRE1表达水平与鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤的临床分期呈正相关。另外,可通过MACC1和p-IRE1阳性表达来预测鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者的预后情况,且MACC1和p-IRE1为鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤的预后独立因素。

肌醇需求酶1信号通路在自噬改善大鼠冠心病心肌缺血损伤中的作用

目的:基于探讨肌醇需求酶1(IRE1)信号通路在自噬改善大鼠冠心病心肌缺血损伤中的作用。方法:将H9c2细胞分为对照组、IRE1组、缺氧缺糖(OGD)/复氧(OGD/R)组、OGD/R+IRE1组、氯喹组、IRE1+氯喹组、OGD/R+氯喹组、OGD/R+IRE1+氯喹组、OGD组、OGD+氯喹组、OGD/R+IRE1+敲低X盒结合蛋白1(si-XBP1)组、OGD/R+IRE1+过表达X盒结合蛋白1(XBP1-OE)组。通过自噬双标腺病毒(Adv-RFP-GFP-LC3)评估各组细胞的自噬通量。通过免疫荧光和免疫印迹分析X盒结合蛋白1(XBP1)的核转位。另将32只成年雄性C57BL/6 J小鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注(I/R)组、IRE1组和I/R+IRE1组,每组8只。通过超声心动图评估大鼠心功能。通过定量免疫印迹分析自噬相关蛋白。结果:(1)细胞试验:与OGD/R组比,OGD/R+IRE1组H9c2细胞中IRE1蛋白表达水平显著增加(P<0.001),微管相关蛋白轻链3蛋白Ⅱ(LC3Ⅱ)和泛素结合蛋白(p62)蛋白表达均显著降低(P均<0.05)。与OGD/R+氯喹组比,OGD/R+IRE1+氯喹组H9c2细胞中LC3Ⅱ和p62蛋白表达均显著增加(P均<0.05)。与对照组比,OGD/R组H9c2细胞中IRE1细胞核/细胞质荧光强度比显著增加(P<0.001);与OGD/R组比,OGD/R+IRE1组IRE1细胞核/细胞质荧光强度增加(P<0.001)。与OGD/R组比,OGD/R+IRE1组核蛋白中的XBP1水平增加(P<0.05)。与OGD/R+IRE1组比,OGD/R+IRE1+si-XBP1组黄色点状体显著减少(P<0.01),OGD/R+IRE1+XBP1-OE组黄色点状体显著增加(P<0.05)。(2)大鼠体内实验:与假手术组比,I/R组左心室射血分数和短轴缩短率均显著降低(P均<0.05)。与I/R组比,I/R+IRE1组心功能障碍改善(P均<0.05)。与假手术组比,I/R组心肌自噬空泡的数量、IRE1、LC3Ⅱ和p62表达均显著增加(P均<0.05)。与I/R组比,I/R+IRE1组心肌自噬空泡的数量、p62表达均显著降低(P均<0.05),心肌组织中IRE1、LC3Ⅱ的表达均增加(P均<0.05)。结论:IRE1通过促进XBP1的核转位恢复了OGD/R和I/R诱导的自噬通量阻断,自噬通量的恢复有助于保护心功能。

肌醇需求酶1对顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡的作用研究

目的 研究肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)对顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡的作用。方法 分离生后3~5 d的健康昆明小鼠(500只)耳蜗基底膜并进行体外培养,24 h后随机分为对照组和不同浓度顺铂组(4、8、16和32μg/ml)(每组200条),再培养24 h。应用异硫氰酸荧光素(FITC)染色观察小鼠耳蜗毛细胞的缺失;应用Hoechst 33258和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的鬼笔环肽双重荧光染色观察小鼠耳蜗毛细胞的凋亡;并用Western blot检测小鼠耳蜗中p-IRE1α、p-JNK、Bax及caspase-3的蛋白水平。结果 与对照组比较,顺铂组小鼠耳蜗毛细胞缺失、细胞凋亡率以及p-IRE1α、p-JNK、Bax、caspase-3等蛋白水平显著增高(P<0.01),并且p-IRE1α与Bax、caspase-3表达和细胞凋亡率呈正相关(P<0.05)。结论 IRE1可能参与调控顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡。

肌醇酶1信号通路对氟诱导的成骨细胞分化的影响

目的观察染氟成骨细胞未折叠蛋白反应肌醇酶1（IRE1）-Xbp1信号通路的表达及siRNA干扰抑制IRE1表达后成骨细胞内成骨细胞标志物的变化趋势。方法细胞增殖毒性（CCK-8）实验检测成骨细胞MC3T3-E1增殖活性，设置0．0、0．1、1．0、2．0、4．0、8．0、16．0、20．0、32．0、64．0mg／L10个不同氟含量组；选取具有代表性的低、中、高剂量氟（含量分别为2．0、8．0、20．0mg／L）作用于MC3T3-E1细胞2d，采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）检测MC3T3-E1细胞中未折叠蛋白反应相关基因和成骨细胞标志物[碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、Runx2、osterix、免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、活化转录因子6（ATE6）、Xbp1]的表达：IRE1siRNA转染MC3T3-E1细胞并联合染氟，Real-timePCR和蛋白免疫印迹法检测MC3T3-E1细胞中IRE1信号通路和成骨细胞标志物的表达。结果CCK-8检测结果显示氟的双向效应，即与0．0mg／L组[1．00±0．01（1d）、1．00±0．02（3d）、1．00±0．08（7d）]比较，成骨细胞活性在2．0mg／L染氟组[1．11±0．02（1d）、1．29±0．02（3d）]、8．0mg／L染氟组[1．16±0．02（1d）、1．44±0．03（3d）]显著增强（P均〈0．05），而2（1．0mg／L染氟组却抑制细胞活性[0．83±0．01（1d）、0．81±0．01（3d）、0．96±0．04（7d），P均〈0．05]。2．0mg／L染氟组显著诱导MC3T3-E1细胞内ALP（12．80±3．62）、Runx2（6．61±0．48）和osterix（21．42±1．56）的表达，与0．0mg／L组（6．86±2．13、2．65±0．38、12．48±3．96）比较，差异有统计学意义（P均〈0．05），而20．0mg／L染氟组抑制ALP（0．88±0．17）、OCN（0．16±0．05）和osterix（1．35±0．51）的表达，与0．0mg／L组[4．58±1．52（OCN）]比较，差异均有统计学意义（P均〈0．05）。与0．0mg／L组[1．36±0．58（IRE1）、0．96±0．45（Xbp1）]比较，IRE1[14．84±2．57（2．0mg／L）、4．10±0．52（8．0mg／L）、5．30±0．63（20．0mg／L）]和Xbp1[2．62±0．66（2．0mg／L）、1．97±0．47（20．0mg／L）]基因表达在染氟组中均显著升高（P均〈0．05）。IRE1基因敲除后，与对照组比较[基因：3．25±0．48（OCN）、5．62±1．86（Runx2）、2．67±0．35（ALP）；蛋白：0．16±0．03（OCN）、0．34±0．27（ALP）]，OCN基因表达[0．63±0．46（2．0mg／L）、0．81±0．36（8．0mg／L）、0．62±0．31（20．0mg／L）]、Runx2基因表达[0．18±0．03（2．0mg／L）、0．12±0．01（8．0mg／L）、1．09±0．33（20．0mg／L）]和ALP基因表达[1．01±0．12（8．0mg／L）、0．38±0．09（20．0mg／L）]在染氟组均显著下降（P均〈0．05），OCN蛋白表达[0．06±0．02（2．0mg／L）、0．06±0．02（8．0mg／L）、0．07±0．03（20．0mg／L）]、ALP蛋白表达[0．02±0．01（8．0mg／L）、0（20．0mg／L）]在染氟组均显著下降（P均〈0．05）。结论不同剂量的氟作用下成骨细胞内均出现未折叠蛋白反应，IRE1基因敲除能够抑制低氟诱导的成骨细胞内ALP、OCN和关键转录因子Runx2、osterix的表达，提示IRE1信号通路在氟诱导的成骨细胞的分化过程中有-定作用。

高产肌醇-1-磷酸合酶大肠杆菌重组工程菌的构建及其产肌醇发酵条件优化

该研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC288基因组为模版,利用基因工程技术克隆肌醇合成途径关键酶肌醇-1-磷酸合酶(IPS)的表达基因INO1,以质粒pETDuet-1为载体,构建重组质粒pETDuet-INO1,导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,构建重组菌株E.coli BL21/pETDuet-INO1,实现IPS在大肠杆菌高效表达,并采用单因素试验及正交试验对其产肌醇的发酵条件进行优化。结果表明,成功构建重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet-INO1,其发酵产肌醇的最佳工艺条件为:初始葡萄糖添加量12 g/L,诱导温度28℃,接种量3%。在此条件下进行诱导发酵24 h,肌醇产量高达(0.81±0.007)g/L,比优化前提高60.39%。

需肌醇酶1介导的内质网应激通路参与高氧所致早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡

目的探讨需肌醇酶1(IRE1)介导的内质网应激通路与高氧暴露肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)凋亡的关系。方法原代培养早产大鼠AECⅡ,随机分为空气组和高氧组,建立高氧细胞损伤模型。在24、48及72h收集细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态变化;AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR及Westernblot分别检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、IRE1、X盒结合蛋白1(XBP1)及C/EBP同源蛋白(CHOP)m RNA及蛋白表达;免疫荧光检测CHOP表达。结果随着给氧时间延长,高氧组AECⅡ伸展呈不规则形,出现空泡样改变;高氧组AECⅡ凋亡率与同时间点空气组比较明显增加(P<0.05);随着氧暴露时间延长,高氧组GRP78、IRE1、XBP1及CHOPm RNA及蛋白表达升高,且较同时间点空气组明显上升(P<0.05);高氧组CHOP荧光强度高于同时间点空气组。高氧组CHOP蛋白表达与AECⅡ凋亡率、IRE1及XBP1蛋白表达呈显著正相关(r=0.97、0.85、0.88,均P<0.05)。结论高氧所致AECⅡ凋亡可能是通过激活IRE1-XBP1-CHOP通路来实现。

肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜需肌醇酶1a、肿瘤坏死因子受体相关因子2的表达与意义

目的 通过建立大鼠小肠缺血再灌注损伤（IIRI）模型，探讨肠组织需肌醇酶1仪（IREIot）与肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）的表达及意义。方法雄性SD大鼠50只，按随机数字表法分为假手术组（sham组，例数=10）和肠缺血再灌注组（I／R组，例数=40）。sham组仅开腹、关腹；I／R组给予阻断肠系膜上动脉血流30min，恢复再灌注2h、6h、12h、24h分为4个亚组，依据每个亚组存活数量取8只统计。光镜下观察HE染色小肠组织病理学改变，细胞凋亡原位检测法（TUNEL法）检测小肠黏膜上皮细胞凋亡指数（AI），酶联免疫吸附法（ELISA法）检测小肠组织TNF-a及血浆小肠脂肪酸结合蛋白（I-FABP）的水平，Westernblot法检测小肠组织内质网应激（ERS）蛋白IREld、磷酸化IREloc（P—IREld）、TRAF2的表达。结果1．光镜示MR组各亚组较sham组小肠损伤明显，6h组损伤最重。2．MR组肠组织TNF-a[sham组：（16．41±4．44）ng／L，2h组：（79．71±8．20）ng／L，6h组：（131．70±11．59）ng／L，12h组：（94．23±7．66）ng／L，24h组：（69．78±9．58）ng／L]、小肠黏膜上皮细胞AI[sham组：（3．93±0．77）％，2h组：（16．24±1．97）％，6h组：（42．19±2．40）％，12h组：（37．79±2．34）％，24h组：（10．38±1．46）％]及I-FABP水平[sham组：（0．65±0．10）×10^3ng／L，2h组：（1．47±0．10）×10^3ng／L，6h组：（2．36±0．17）×10^3ng／L，12h组：（37．79±2．34）×10^3ng／L，24h组：（1．41±0．09）×10^3g／L]较sham组显著升高（F=231．462、149．032、162．491，P均〈0．01）。3．L／R组各亚组中p-IRE1a／IRE1d、TRAF2的表达较sham组均明显升高（F=40．473、59．59，P均〈0．01），再灌注2h表达升高，6～12h维持较高表达，24h表达明显下调，且p-IRE1a／IRE1a值的改变与TRAF2在各组中的表达变化趋势一致。结论IIRI诱发ERS，激活IRE1a，上调TRAF2的表达；IRE1／TRAF2介导ERS可能参与了IIRI的炎性反应与细胞凋亡过程，增加肠道通透性。

需肌醇酶-1-c-Jun氨基末端激酶通路在周期性应力介导的成肌细胞凋亡中的作用

目的 观察在周期性应力介导成肌细胞凋亡中内质网应激需肌醇酶-1（IRE-1）-c-jun氨基端激酶（JNK）信号通路的作用.方法 以大鼠L6成肌细胞为实验对象,构建体外培养-力学刺激模型.应用应力加载装置分别加1、2、6、12、24 h的周期性张应力（拉伸变形率为15％,频率为10次循环/分）,对照组不加力（0 h）.Hochest 33258染色、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙锭（PI）流式细胞术分别检测凋亡细胞的数目及凋亡率;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测内质网应激相关因子C/EBP同源蛋白（CHOP）、凋亡信号调节激酶-1（ASK-1）、肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）和JNK mRNA的表达变化;加入IRE-1特异性抑制剂STF-083010,检测ASK-1、TRAF2和JNK mRNA的表达变化.结果 随应力加载时间的延长,凋亡细胞的数目、凋亡率呈一致上升趋势,且在24h达峰值[（14.34±0.77）个];CHOP、ASK-1、TRAF2mRNA表达量随着应力加载时间的延长逐渐上升,并在24 h达最高值,分别为4.19±1.76、3.46±0.84、3.78±1.38（P ＜0.05）,JNK mRNA的表达量在0～2h逐渐上升后逐渐下降,随后又逐渐上升在24 h达最高值（3.04±0.79,P＜0.05）;加入大鼠IRE-1特异性抑制剂STF-083010后,TRAF2、ASK-1表达量均明显减少（P＜0.05）.结论 周期性张应力可诱导成肌细胞的凋亡,凋亡率随着应力加载时间的延长而升高.CHOP、TRAF2、ASK-1、JNK mRNA的表达量升高,提示内质网相关的凋亡途径参与了应力介导的成肌细胞的凋亡.加入IRE-1抑制剂后,TRAF2、ASK-1、JNK mRNA表达量均明显降低,提示IRE-1-JNK通路参与了应力介导的成肌细胞凋亡.

鼻咽癌癌组织中CD133、丝裂原活化蛋白激酶4、需肌醇酶1蛋白表达与放疗预后的相关性研究

目的分析鼻咽癌癌组织中CD133、丝裂原活化蛋白激酶4(MKK4)、需肌醇酶1(p-IRE1)蛋白表达与放疗预后的相关性,以期为临床诊治鼻咽癌及评估预后提供信息。方法将2012年5月-2013年12月于本院开展放疗治疗的94例鼻咽癌患者作为观察对象,经SP免疫组化法对鼻咽癌患者癌组织内CD133、MKK4、p-IRE1蛋白表达情况进行分析,并给予患者放射治疗;探讨癌组织中CD133、MKK4、p-IRE1蛋白表达和鼻咽癌临床特征、放疗预后相关性。结果鼻咽癌癌组织内CD133、MKK4、p-IRE1蛋白的阳性表达率分别为68. 1%、75. 5%、67. 0%;35例患者呈CD133低表达,59例患者呈CD133高表达;38例患者呈MKK4低表达,56例患者呈MKK4高表达;69例患者呈p-IRE1低表达,25例患者呈p-IRE1高表达;Logistic回归分析发现:癌组织内CD133、MKK4、p-IRE1蛋白阳性表达与鼻咽癌临床TNM分期、淋巴结转移存在相关性(P <0. 05);鼻咽癌癌组织内CD133、MKK4、p-IRE1蛋白低表达患者放疗后5年总生存率均高于CD133、MKK4、p-IRE1蛋白高表达患者(P <0. 05)。结论 CD133、MKK4蛋白于鼻咽癌的癌组织内均呈高表达,p-IRE1蛋白于鼻咽癌的癌组织内呈低表达;同时,癌组织内CD133、MKK4、p-IRE1蛋白表达和鼻咽癌临床分期、淋巴结转移及放疗预后关系密切,可作临床诊治鼻咽癌及评估预后的重要指标。

阿霉素对心肌肌醇依赖酶l-JNK通路的影响

目的探讨肌醇依赖酶l(IRE1)-JNK通路是否参与阿霉素致心力衰竭(HF)效应的作用。方法阿霉素(adriamycin,Adr)致HF大鼠作为Adr组(n=15),同龄健康大鼠作为对照组(n=10);将乳鼠心肌细胞随机分为对照组和Adr组(1umol/L)。心脏超声后,流式细胞仪和蛋白印迹等分别检测细胞凋亡率(AR)、IRE 1、X盒结合蛋白1(XBP l)、TNF受体相关因子2(TRAF 2)、c-Jun凋亡信号调节激酶(ASK1)和JNK等的表达。结果 1.Adr在体成功构建HF模型,而体外干预显著增加心肌细胞AR(P<0.001);2.不管在体内抑或在体外,Adr组IRE1α和p-IRE1α水平均显著高于相应对照组(P<0.001);3.与相应对照组相比,Adr组XBP l蛋白均显著上调(P<0.001);4.体内和体外Adr组TRAF 2蛋白的表达显著高于相应对照组(P<0.001);5.Adr组ASK1、p-ASK1和磷酸化水平(即p-ASK1与总ASK1比值)显著高于相应对照组(P<0.001);6.不管在体内抑或在体外,Adr组JNK1/2、p-JNK1/2蛋白和其磷酸化水平(p-JNK1/2与总JNK1/2比值)均显著高于相应对照组(P<0.001)。结论 Adr通过肌醇依赖酶l(IRE1)-ASK-JNK内质网通路介导其致心肌毒性并进而促发HF。

微小RNA-155/含有SH2结构的5肌醇磷酸酶-1与非酒精性脂肪性肝病患者发生心血管事件的相关性

目的分析微小RNA-155(microRNA,miR-155)-155/含有SH2结构的5肌醇磷酸酶-1(SHIP-1)与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者发生心血管事件的相关性。方法选取2018年3月-2019年7月云南省第一人民医院收治的NAFLD患者104例,以及同期接受健康体检志愿者110例作为对照组。检测两组受试者BMI、血压及空腹血糖(FPG)、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil等指标,采用荧光定量PCR法检测两组受试者外周血miR-155及SHIP-1 mRNA表达。计量资料2组间比较采用t检验;计数资料组间比较采用χ^2检验;等级资料组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。相关性检验采用Pearson分析。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析miR-155/SHIP-1值对患者心血管事件的预测价值。结果NAFLD组患者BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT、TBil水平均明显高于对照组,HDL-C水平明显低于对照组,miR-155 mRNA相对表达量明显高于对照组,SHIP-1 mRNA相对表达量明显低于对照组,且miR-155/SHIP-1值、心血管事件发生率均明显高于对照组,差异均有统计学意义(t值分别为6.617、9.323、6.668、8.633、4.285、22.099、24.093、20.438、12.366、6.515、18.893、18.411、29.967,χ^2=10.476,P值均<0.01)。根据患者miR-155/SHIP-1值将患者分为3组,3组间BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil以及心血管事件发生率比较,差异均有统计学意义(H值分别为20.923、7.936、6.256、16.181、21.572、8.435、18.912、22.869、7.665、18.657、9.701,P值均<0.05)。miR-155/SHIP-1值与BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT、TBil呈显著正相关(r值分别0.297、0.317、0.332、0.327、0.286、0.334、0.352、0.342、0.350,P值均<0.001),与HDL-C呈显著负相关(r=-0.279,P<0.001)。发生心血管事件患者miR-155/SHIP-1值(3.642±1.082)明显高于未发生心血管事件患者(2.237±0.703),差异有统计学意义(t=11.104,P<0.05);miR-155/SHIP-1值预测NAFLD患者发生心血管事件的ROC曲线下面积为0.902。结论NAFLD患者糖脂代谢及肝功能异常与miR-155/SHIP-1表达密切相关,且miR-155/SHIP-1值对NAFLD患者发生心血管事件具有一定的预测价值。

内质网跨膜蛋白肌醇需求酶1α介导的凋亡通路在兔骨关节炎发病中的作用及机制

目的探讨内质网跨膜蛋白肌醇需求酶(IRE)1α介导的凋亡通路在骨关节炎(OA)发病中的作用及机制。方法新西兰兔膝关节注射木瓜蛋白酶模拟OA模型,HE染色检测OA关节软骨以及关节滑膜的形态,ELISA法检测OA关节滑膜中炎性因子白细胞介素(IL)-6的含量。检测闭合性松解术关节软骨的组织形态以及IL-6的含量。Western印迹检测IRE1α介导的凋亡通路在OA滑膜中的表达水平。结果 HE染色结果显示木瓜蛋白酶诱导的OA模型中,关节软骨细胞发生明显坏死,纤维组织变性、机化以及纤维蛋白坏死物沉积,ELISA结果显示关节滑膜中的IL-6水平明显升高,闭合性松解术后的OA关节软骨细胞凋亡减少,且关节滑膜中IL-6水平也明显降低。蛋白水平显示OA膝关节滑膜中IRE1α的磷酸化水平以及Caspase3的表达水平明显升高,介导关节软骨细胞的凋亡,而闭合性松解术后Caspase3的表达水平降低。结论闭合性松解术可缓解OA的症状,抑制IRE1α-Caspase3信号通路介导的凋亡作用。

基于豚鼠呼吸区鼻黏膜形态及肌醇需求酶1α蛋白表达研究醒鼻凝胶滴鼻剂干预变应性鼻炎的机制

目的观察醒鼻凝胶滴鼻剂对变应性鼻炎豚鼠呼吸区鼻黏膜形态及肌醇需求酶1α(IRE1α)表达的影响,探讨其治疗变应性鼻炎的可能机制。方法选取60只Hartley品系、鼠龄为2~3个月健康普通级豚鼠,雌雄各半。采用简单数字随机及性别、体重的分层随机法分为空白组、模型组、醒鼻凝胶滴鼻剂低剂量组、醒鼻凝胶滴鼻剂中剂量组、醒鼻凝胶滴鼻剂高剂量组、雷诺考特组,每组10只。除空白组外,其余组以卵清蛋白构建变应性鼻炎豚鼠模型。于造模第16天起,模型组给予生理盐水滴鼻,醒鼻凝胶滴鼻剂低、中、高剂量组分别给予6.88 mg/kg、13.76 mg/kg、27.52 mg/kg醒鼻凝胶滴鼻剂滴鼻,雷诺考特组给予20μg/kg雷诺考特滴鼻,均2次/d,连续11 d。干预结束后,取各组豚鼠呼吸区鼻黏膜进行扫描电镜观察,取鼻黏膜、肺组织采用Western blot法检测IRE1α蛋白表达情况。结果扫描电镜下模型组豚鼠呼吸区纤毛柱状上皮表面微绒毛、纤毛结构缺失,排列混乱,方向不一致,且柱状上皮细胞之间的间隙增宽;醒鼻凝胶滴鼻剂中剂量组豚鼠呼吸区纤毛传输系统有改善;醒鼻凝胶滴鼻剂高剂量组和雷诺考特组柱状上皮细胞排列较整齐,纤毛生长较好,排列有明显的方向性,并可见腺体分泌细胞。模型组豚鼠鼻黏膜、肺组织中IRE1α蛋白表达水平均明显高于空白组(P均<0.05),各给药组豚鼠鼻黏膜、肺组织中IRE1α蛋白表达水平均明显低于模型组(P均<0.05),且鼻黏膜中的IRE1α蛋白表达水平降低与醒鼻凝胶滴鼻剂给药浓度呈负相关。结论醒鼻凝胶滴鼻剂可在一定程度上修复变应性鼻炎纤毛柱状上皮细胞的纤毛,其可能通过调节鼻黏膜及肺组织中IRE1α蛋白的表达发挥减轻气道炎性反应的作用。

拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA(AtMIPS1),开放读码框为1533 bp,编码510个氨基酸.与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86%～90%与95%～96%,并含有MIPS基因的保守区域'334SYNHLGNNDG'.将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a(+)原核表达载体上,SDS-PAGE结果表明:在0.12g/L IPTG诱导2 h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础.

伊钮小单孢菌2-脱氧蟹肌醇氨基转移酶基因sisM的克隆与表达

从伊钮小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中扩增到参与西索米星生物合成基因sisM,其开放阅读框长1263bp,编码含421个氨基酸残基(44.3ku)的蛋白质。经Blast比对,该蛋白与已报道的L-谷氨酰胺:2-脱氧蟹肌醇(DOI)氨基转移酶有很高的同源性,据此推测sisM是编码DOI氨基转移酶的基因。该基因在IPTG诱导下.在大肠埃希菌BL21(DE3)实现了表达,表达产物的分子量与推测的一致。这是从伊钮小单孢菌克隆到的又一参与西索米星核心基团2-脱氧链霉胺(DOS)生物合成的新基因,该基因在GenBank的登录号为EU074791。