基于肌醇需求激酶1α/c-Jun氨基末端激酶信号通路探讨胆宁片干预非酒精性脂肪性肝病的作用及机制

目的基于肌醇需求激酶1α/c-Jun氨基末端激酶(IRE1α/JNK)信号通路,探讨胆宁片对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型大鼠的作用及机制。方法将32只SD大鼠随机分为正常饮食组(A组,等体积生理盐水,8只)和高脂饮食组(24只);高脂饮食组大鼠喂养10周复制NAFLD模型成功后,再随机分为模型组(B组,等体积生理盐水)、多烯磷脂酰胆碱组[C组,142.5 mg/(kg·d)]和胆宁片组[D组,562.5 mg/(kg·d)],各8只。各组小鼠均灌胃相应药物干预6周。测定大鼠的体质量、血糖(GLU);采用苏木精-伊红染色(HE)法观察大鼠肝组织病理形态变化,采用油红染色法观察肝组织脂质沉积;检测血清胰岛素(INS)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;采用免疫印迹(Western blot)法检测肝组织IRE1α、JNK1、磷酸化胰岛素受体底物1(p-IRS1)的蛋白表达水平。结果与B组比较,D组大鼠血糖和TC,TG,LDL-C,NEFA,ALT,AST水平均显著降低(P<0.01),血清INS和HDL-C水平显著升高(P<0.01);脂肪变性程度及细胞肿胀明显减轻,脂滴空泡体积缩小,数量减少;肝脏IRE1α,JNK1,p-IRS1蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。结论胆宁片可能通过下调IRE1α/JNK信号通路,减轻肝脏脂肪变性,从而改善NAFLD。

NLRP3-CAMKⅡ-IRE-1α通路激活诱导氧化应激增强对糖尿病大鼠心室重构的影响

目的探讨核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体通过钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)激活肌醇需求激酶-1α(IRE-1α)促进氧化应激增强在糖尿病大鼠心室重构中的作用及机制。方法36只健康雄性Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为对照组(CTL组)、糖尿病组(DM组)和糖尿病+格列苯脲组(GLB组),每组12只。大鼠通过单次腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素制备糖尿病模型,GLB组于造模成功后给予NLRP3抑制剂格列苯脲(1.25 mg/kg),连续灌胃8周。CTL组不进行任何干预。8周后记录各组血糖、血压、体质量,计算心室体质量比,测量血流动力学指标;心脏超声检查评估肺动脉血流加速时间、平均肺动脉压、收缩期与舒张期室间隔、心室前壁和心室后壁厚度;心外膜激活映射标测进行心外膜传导速度、绝对不均匀性和不均匀指数测定;采用蛋白免疫印迹检测NLRP3、胱天蛋白酶(caspase)-1、CaMKⅡ、IRE-1α、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)2、NOX4的蛋白水平;荧光染色法测定活性氧(ROS)含量;HE及Masson染色观察心室组织细胞形态和纤维化。结果与CTL组相比,DM组的血糖升高,心室体质量比增大,收缩期和舒张期室间隔厚度、左心室前壁厚度增加,体质量降低,左、右心室心外膜传导速度减慢,右心室不均匀指数增加,NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表达水平升高,心室肌ROS产生增多,CVF升高(P<0.05),心室肌细胞排列紊乱,纤维化更明显;与DM组比较,GLB组收缩期和舒张期室间隔厚度、左心室前壁厚度降低,左、右心室心外膜传导速度增快,左心室绝对不均匀性和不均匀指数降低,NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表达水平下降,ROS产生减少,CVF降低(P<0.05),心室肌纤维化程度减轻。结论糖尿病大鼠心室肌细胞NLRP3-CAMKⅡ-IRE-1α通路激活,促进氧化应激增强,参与心室重构,GLB可改善此变化。

丹蛭降糖胶囊对肥胖大鼠骨骼肌IRE1α-JNK信号通路的干预效应

目的探讨丹蛭降糖胶囊对高脂饮食诱导的肥胖大鼠骨骼肌内质网应激(ERs)相关因子肌醇需求激酶1α(IRE1α)、磷酸化IRE1α(p-IRE1α)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为普通饮食组(NC组)、单纯高脂饮食组(HF组)、高脂饮食+丹蛭降糖胶囊组(FD组),每组各10只。应用全自动生化分析仪测定骨骼肌三酰甘油(TG)含量;Western blot检测骨骼肌组织IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK的蛋白表达水平。结果 1NC组、HF组以及FD组骨骼肌内TG含量分别为(1.87±0.72)、(3.03±0.71)、(2.71±0.58)μmol/g。与NC组比较,HF组大鼠骨骼肌TG含量显著增高(P=0.005);与HF组比较,FD组大鼠骨骼肌TG含量明显下降(P=0.024)。2Western blot检测结果显示,HF组p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK较NC组明显升高(P<0.05);FD组p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK较HF组明显降低(P<0.05)。3Pearson相关性分析发现,大鼠骨骼肌TG含量与HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK均呈正相关(r=0.63、0.66、0.57,均P<0.01)。结论丹蛭降糖胶囊可减轻骨骼肌脂质沉积,调节ERs相关IRE1α-JNK通路,从而改善骨骼肌胰岛素抵抗。

GLP-1对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂肪变性的影响

目的从对内质网应激影响的角度,探讨胰升糖素样肽1 (GLP-1)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠肝脏脂肪变性的影响。方法将45只雄性SD大鼠随机均分为三组,各15只。观察组采用高脂饮食造模,并采用GLP-1干预;疾病对照组采用高脂饮食造模,并采用生理盐水干预;正常对照组接受正常饮食,并采用生理盐水干预。在干预4周后,测定大鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平。随后处死大鼠,测定肝匀浆中TG、TC水平,并通过HE染色观察肝脏脂肪变性情况,采用Western印迹法测定肝组织中肌醇需求激酶1α(IRE1α)、磷酸化IRE1α(PIRE1α)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(P-JNK)水平。结果三组大鼠血清TG、TC、AST均呈疾病对照组最高、观察组次之、正常对照组最少趋势,组间比较差异均有统计学意义(P <0.05)。血清ALT,肝匀浆中TC、TG,肝匀浆P-IRE1α/IRE1α、P-JNK/JNK水平均呈疾病对照组最高、正常对照组次之、观察组最少趋势,组间比较差异均有统计学意义(P <0.05)。HE染色显示正常对照组肝脏组织结构正常,疾病对照组呈明显脂肪变性,观察组在两者之间。P-IRE1α/IRE1α、P-JNK/JNK均与肝脏脂肪变性程度呈明显正相关(ρ=0.617,0.730;P均<0.001)。结论 GLP-1能够抑制NAFLD大鼠肝脏脂肪变性,其机制可能与调节内质网应激中IRE1α-JNK通路有关;应用GLP-1类似物可能有助于治疗NAFLD。

肌醇需求激酶1抑制剂对染矽尘大鼠肺纤维化干预作用研究

目的研究肌醇需求激酶1(IRE1)抑制剂对染矽尘大鼠肺纤维化内质网应激(ERS)凋亡途径的影响,评价IRE1抑制剂对大鼠矽肺纤维化的干预作用。方法无特定病原体(SPF)级健康成年雄性SD大鼠24只随机分为对照组、矽肺组和IRE1组,每组8只。矽肺组和IRE1组大鼠均采用非气管暴露法一次性注入质量浓度为50.0 g/L的二氧化硅混悬液1.0mL造模,对照组注入等体积灭菌生理氯化钠溶液。造模28 d后,IRE1组大鼠腹腔注射剂量为1.0 mg/kg体质量的IRE1抑制剂,其余2组予等体积灭菌生理氯化钠溶液,每7天注射1次,共4次。造模后第56天处死大鼠,收集左侧肺泡灌洗液,分离、纯化和培养肺泡巨噬细胞(AM)。观察肺组织病理变化情况,实时荧光定量聚合酶链式反应测定肺组织Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平,流式细胞术检测AM活性氧(ROS)阳性率和线粒体去极化率,免疫印迹法测定肺组织内IRE1α、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的相对表达水平。结果肺组织病理学检查结果显示,矽肺组肺组织可见炎细胞浸润和典型矽结节形成;IRE1组可见普遍炎细胞浸润和肺泡间隔变大,有弥漫性纤维化改变,但未见矽结节形成。IRE1组、矽肺组大鼠肺组织Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平和AM的ROS阳性率、线粒体去极化率均高于对照组(P<0.01),IRE1组上述4个指标均低于矽肺组(P<0.01)。IRE1组、矽肺组大鼠肺组织IRE1α、Caspase-12和Bax蛋白的相对表达水平均高于对照组(P<0.01),IRE1组大鼠上述3个指标均低于矽肺组(P<0.01);但IRE1组和矽肺组大鼠肺组织Bcl-2相对表达水平均低于对照组(P<0.01),IRE1组大鼠Bcl-2相对表达水平高于矽肺组(P<0.01)。结论 IRE1参与的ERS凋亡通路可能在矽肺肺纤维化的发生和发展中发挥着重要作用;IRE1抑制剂可以通过阻断IRE1通路拮抗ERS诱导的AM凋亡,从而拮抗肺纤维化。

清热化瘀颗粒对脑缺血预处理大鼠肌醇需求激酶1表达的影响

目的:观察清热化瘀颗粒对脑缺血预处理大鼠缺血再灌注后肌醇需求激酶1(IRE1)mRNA及其蛋白表达的影响。方法:健康雄性SD大鼠80只,随机分为4组:假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)、清热化瘀颗粒组(QRHY),每组按再灌注后12 h,1,2,3 d 4个时间点平均分为4个亚组。制备脑缺血预处理模型,缺血预处理后给大鼠灌胃14 mL·kg-1清热化瘀颗粒溶液,连续3 d,每天上、下午各1次,MCAO组和BIP组给予等量的生理盐水。用实时荧光定量PCR和Western blot法观察再缺血后各个时间点IRE1mRNA及其蛋白的表达变化。结果:MCAO组IRE1mRNA及其蛋白表达均于缺血再灌注后12 h开始明显上升,1 d达高峰(P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降,但仍保持较高表达水平(P<0.01);BIP组较MCAO组IRE1mRNA及其蛋白表达明显升高(P<0.05或P<0.01),QRHY组较BIP组进一步升高其表达(P<0.05或P<0.01)。结论:脑缺血预处理能够诱导脑缺血损伤后IRE1的表达,清热化瘀颗粒可进一步促进其表达。

大鼠局灶性脑缺血预处理后IRE1表达的变化

目的观察缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后肌醇需求激酶1(IRE1)mRNA及其蛋白表达和神经元凋亡的影响。方法 SD大鼠120只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP),每组按照再缺血后12 h、1 d、2 d、3 d 4个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,分别用实时荧光定量PCR和Western blot法观察再缺血后各个时间点IRE1 mRNA及其蛋白表达的变化,用流式细胞术检测神经细胞凋亡率。结果 (1)MCAO组12 h IRE1 mRNA及其蛋白表达开始明显升高,24 h达高峰(P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降;BIP组较MCAO组IRE1 mRNA及其蛋白各时间点表达均明显升高(P<0.05,P<0.01)。(2)MCAO组12 h细胞凋亡发生率明显增加,24 h时达到高峰(P<0.01),以后逐渐下降;BIP组各个时间点神经元凋亡发生率较MCAO组明显降低(均P<0.05)。结论脑缺血预处理可能通过诱导内质网应激后IRE1的表达发挥其神经保护作用。

姜黄素对2型糖尿病大鼠神经病理性痛及脊髓背角和背根神经节IRE1α表达的影响

目的评价姜黄素对2型糖尿病大鼠神经病理性痛及脊髓背角和背根神经节肌醇需求激酶1αIRE1α）表达的影响。方法高脂高糖喂养雄性SD大鼠8周诱导胰岛素抵抗，以35mg／kg链脲佐菌素（STZ）单次腹腔注射，3d后血糖≥16．7mmol／L大鼠为2型糖尿病大鼠。注射STZ14d后机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）低于基础值80％的大鼠为2型糖尿病神经病理性痛大鼠，采用随机数字表法，将其随机分为3组（n=27）：2型糖尿病神经病理性痛组（DNP组）、姜黄素组（Cur组）和溶剂对照组（SC组）。Cur组和SC组于注射STZ14d后腹腔注射姜黄素或玉米油100mg／kg（25mg／ml），1次／d，连续14d，DNP组不做任何处理。另取27只正常大鼠为对照组（C组），给予普通饲料喂养。给予姜黄素后第3、7和14天时测定MWT和侧L，痛阂测定后用Westernblot法检测大鼠脊髓背角和背根神经节IRE1α的表达。结果与C组比较，DNP组、Cur组和SC组MWT降低，TWL缩短，脊髓背角和背根神经节IRE1α表达上调（P〈O．05）；与DNP组比较，Cur组MWT升高，TWL延长，脊髓背角和背根神经节IRE1α表达下调（P〈0．05）。sc组和DNP组上述指标比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论姜黄素可减轻2型糖尿病大鼠神经病理性痛，其机制与抑制脊髓背角和背根神经节IRE1α表达有关。

胰升糖素样肽1类似物对非酒精性脂肪肝大鼠IRE1α-JNK通路的干预效应

目的探讨非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠肝脏组织内质网应激（ERs）相关因子肌醇需求激酶1α（IRE1α）、磷酸化1RE1α（p-IRE1α）、c-jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）的表达情况，观察胰升糖素样肽1（GLP-1）类似物的干预作用。方法将40只雄性sD大鼠分为正常饮食组（n=15）和高脂饮食组（n=25），喂养12周后，每组取5只评估NAFLD大鼠模型的建立，再将高脂饮食组大鼠分为高脂饮食组（HF，n=10）和GLP—1组（HG，n=10），分别以生理盐水及GLP-1类似物干预4周，测定大鼠体重及生化指标，Western印迹法检测肝组织IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK的蛋白表达水平。结果HF组大鼠的体重、血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、丙氨酸转移酶（ALT）、天冬氨酸转移酶（AST）较正常饮食组明显升高（均P〈0．01），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）明显降低（P〈0．01），p-IRE1α/IRE1α及p-JNK／JNK升高（P〈0．05及P〈0．01），而高脂喂养的大鼠经GLP-1类似物干预后，体重、TG、TC、LDL-C、AST、ALT明显降低（P〈0．05或P〈0．01），HDL-C明显升高（P〈0．01），p-IRE1α/IRE1α及P—JNK／JNK降低（P〈O．05及P〈0．01）。结论GLP-1类似物可能通过调节ERs相关IRE1α-JNK通路改善肝脏脂肪变性。

黄芪桂枝五物汤通过调节内质网应激对MKR小鼠糖尿病周围神经病变的作用

目的:探讨黄芪桂枝五物汤通过调控内质网应激c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路相关蛋白治疗糖尿病周围神经病变的作用机制。方法:8周龄骨骼肌特异性胰岛素样生长因子^(-1)受体功能缺失小鼠(MKR小鼠)32只,雌雄各半,予高脂饲料喂养4周后,1%链脲佐菌素(STZ)连续腹腔注射5 d;血糖稳定后,每天将小鼠放入铺满冰袋的喂养笼,使其在冰上活动1 h,持续4周。将空腹血糖值≥11.1 mmol·L^(-1)的小鼠随机分为模型组、黄芪桂枝五物汤原方剂量组(30 g·kg^(-1)·d^(-1))、黄芪桂枝五物汤方剂学剂量组(6.25 g·kg^(-1)·d^(-1))、阳性药物(甲钴胺)组(0.17 mg·kg^(-1)·d^(-1))。另设同龄MKR鼠8只作为空白组;FVB鼠8只作为正常组。各组灌胃药物4周后,测定小鼠空腹血糖(FBG)的变化,苏木素-伊红(HE)染色和透射电镜对坐骨神经组织形态进行观察,免疫组化法、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测坐骨神经组织内质网应激相关蛋白JNK、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)与肌醇需求激酶1α蛋白(IRE1α)的表达变化。结果:小鼠行为学与功能学检测显示,与正常组和空白组比较,模型组小鼠缩足舔足、甩尾时间显著缩短(P<0.01),坐骨神经传导速度显著降低(P<0.01);与模型组比较,黄芪桂枝五物汤处理后,能够明显改善小鼠行为学与功能学检测指标(P<0.05,P<0.01)。免疫组化结果显示,与正常组和空白组比较,模型组小鼠JNK的表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,黄芪桂枝五物汤处理后,JNK的表达明显降低(P<0.05),但给药组之间差异无统计学意义。Western blot结果显示,与正常组和空白组比较,模型组小鼠坐骨神经IRE1α、p-JNK蛋白表达有不同程度的明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,黄芪桂枝五物汤可以相应下调模型小鼠坐骨神经IRE1α、p-JNK蛋白表达含量(P<0.05,P<0.01);原方剂量组与教材剂量组比较,差异无统计学意义。结论:黄芪桂枝五物汤可改善坐骨神经功能、减轻坐骨神经组织损伤,其机制可能与黄芪桂枝五物汤抑制坐骨神经的内质网应激反应水平有关。

多聚鸟苷酸干预大鼠矽肺纤维化的内质网应激作用机制

目的探讨肌醇需求激酶1(IRE1)介导的内质网应激(ERS)细胞凋亡途径在多聚鸟苷酸(PolyG)干预大鼠矽肺纤维化中的作用及机制。方法将无特定病原体级成年雄性SD大鼠随机分为对照组(24只)、矽肺模型组(24只)、PolyG预防组(16只)和PolyG治疗组(16只),采用一次性吸入式气管滴注法,对照组大鼠予灭菌0.9%氯化钠溶液1 mL,其余3组大鼠均予质量浓度为50.0 g/L的矽尘混悬液1 mL以构建矽肺纤维化大鼠模型。PolyG预防组大鼠于造模当天,PolyG治疗组大鼠于造模第28天,均一次性经尾静脉注射剂量为2.5 mg/kg体质量的PolyG,于PolyG给药后第28和56天各处死大鼠8只。观察各组大鼠肺组织病理改变情况,以免疫印迹法测定葡萄糖调节蛋白-78(GRP78)、IRE1、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Casepase)-3、Casepase-12、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白相对表达水平。结果病理组织学检查结果显示:对照组大鼠肺组织结构正常;矽肺模型组大鼠肺组织肺泡结构破坏严重,出现纤维细胞性结节及大量胶原沉积;PolyG预防组和PolyG治疗组大鼠矽结节及胶原沉积均较矽肺模型组减少。矽肺模型组大鼠肺组织中GRP78、IRE1、CHOP、Caspase-3、Caspase-12、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白相对表达水平均高于对照组(P<0.05)。除PolyG预防组IRE1和CHOP外,PolyG预防组和治疗组大鼠上述7个蛋白指标的表达水平均低于矽肺模型组(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。造模后第56天,PolyG预防组GRP78、IRE1、Caspase-3、Caspase-12、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白相对表达水平均低于PolyG治疗组(P<0.05)。结论 IRE1介导的ERS未折叠蛋白反应可能参与了PolyG干预大鼠矽肺纤维化的过程;PolyG可有效预防和治疗矽肺纤维化,以预防性给药效果更佳。

胰岛素抵抗大鼠肝脏组织p-IRE—lα的表达及意义

采用高脂饲料喂养并经高胰岛素-正常血糖钳夹技术评估,建立胰岛素抵抗大鼠模型.与正常饮食组相比,高脂饮食组大鼠血清游离脂肪酸和基础胰岛素水平升高（P＜0.05）,平均葡萄糖输注率（GIR60-120）降低（P＜0.01）,肝脏组织p-IRE-1α蛋白表达升高（P＜0.05）.并且肝脏组织p-IRE-lα蛋白表达与血清游离脂肪酸水平呈正相关（r=0.627,P＜0.05）.提示高脂饲料喂养可能通过升高血清游离脂肪酸水平,引起肝脏内质网应激,并通过p-IRE-1 α参与胰岛素抵抗的发生.

甘海胃康胶囊联合兰索拉唑治疗老年慢性萎缩性胃炎的效果观察

目的:探讨甘海胃康胶囊联合兰索拉唑治疗老年患者慢性萎缩性胃炎的临床疗效及对肌醇需求激酶1(IRE1)、应激活化蛋白激酶(JNK)蛋白的影响。方法:抽取2018年2月至2020年2月于洛阳市中医院治疗的老年慢性萎缩性胃炎患者164例,按照随机数字表法分为联合组及对照组,每组82例。对照组给予兰索拉唑治疗,联合组在对照组治疗基础上给予甘海胃康胶囊治疗。分析比较两组患者的临床疗效,治疗前后IRE1、JNK蛋白表达OD值、中医症候积分及不良反应发生率。结果:联合组临床治疗总有效率(93.34%,79/82)优于对照组(71.95%,59/82),P<0.05。治疗后,两组IRE1、JNK蛋白表达OD值均降低,且联合组低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组中医症候积分均降低,且联合组低于对照组(P<0.05)。联合组不良反应发生率(4.88%,4/82)与对照组(8.54%,7/82)比较差异未见统计学意义(P>0.05)。结论:甘海胃康胶囊联合兰索拉唑治疗老年慢性萎缩性胃炎患者的临床疗效显著,能够有效降低IRE1、JNK磷酸化水平,改善患者临床症状,且安全性较高。