东方山羊豆肌醇-1-磷酸合酶基因的克隆与分析

探索新的基因和基因组合在植物耐盐性的研究中是至关重要的。本试验根据在不同植物中功能相同的同源基因保守序列设计引物,以250 mM NaCl胁迫后东方山羊豆(Galega.orientalis L.)幼嫩叶片中所提取的总RNA为模板,采用RT-PCR及RACE方法从东方山羊豆中克隆了一种新的肌醇-1-磷酸合成酶基因GoMIPS,cDNA全长1 858 bp,3'非编码区为256 bp,5'非编码区为69 bp,开放阅读框为1 533 bp,编码510个氨基酸。与已报道物种的MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,GoMIPS与其他植物MIPS基因氨基酸相似性高达87%～95%,GoMIPS推导的氨基酸序列中含有植物MIPS基因所具有典型的NAD+结合区(GWGGNNG)和底物结合位点(SYNHLGNNDG),且9种植物NAD+结合区位置比较保守,均起始于第68个氨基酸。这一结果暗示功能结构域在进化过程中具有较高的稳定性。

拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA(AtMIPS1),开放读码框为1533 bp,编码510个氨基酸.与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86%～90%与95%～96%,并含有MIPS基因的保守区域'334SYNHLGNNDG'.将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a(+)原核表达载体上,SDS-PAGE结果表明:在0.12g/L IPTG诱导2 h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础.

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析

旨在克隆滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因GrDXS,并进行表达分析。以滇龙胆转录组为基础,采用RTPCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrDXS基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。滇龙胆GrDXS基因(登录号:KJ624995)全长2145bp,编码714个氨基酸;GrDXS蛋白相对分子质量76.75kD,pI为6.93;属于DXS家族成员,可能定位于叶绿体;主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;具有DXS蛋白的4类保守结构域:焦磷酸硫胺素结合折叠域(IPR029061,69-425、366-555、87-268、315-407、407-558)、类转酮酶嘧啶结合结构域(IPR005475,394-559、394-555)、转酮酶C端/丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结构域II(IPR009014,568-704,572-704)、转酮酶C端结构域(IPR005476,573-696)和1个转酮酶结合位点(IPR020826,500-516);与长春花CrDXS蛋白亲缘关系最近;GrDXS基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为100kD,与预期蛋白大小一致;GrDXS基因主要在叶中表达。

中国汉族、布依族和壮族群体中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因多态性

【目的】探讨人类聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)5个外显子核苷酸多态性。【方法】采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和银染技术检测3个民族(汉族、布依族和壮族)634名正常人PARP-1基因多态性。【结果】在3个民族634名正常人血标本的5个外显子扩增产物SSCP电泳条带中,219名汉族人PARP-1基因5个外显子均未检出多态性条带;203名布依族和212名壮族人PARP-1基因的5个外显子扩增产物中分别有2例的外显子20检出1条多态性条带,其余4个外显子扩增产物未见多态性条带。【结论】PARP-1基因第20外显子上可能存在多态性。

共转染小干扰RNA质粒联合抑制HeLa细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶样基因-1表达

目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)及转酮醇酶样基因-1(transketolase like-1,TKTL-1)是肿瘤细胞磷酸戊糖代谢途径(pentose phosphate pathway,PPP)的2个重要关键调节酶。拟通过共转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体同时沉默人宫颈癌Hela G6PD及TKTL-1后,观察其对G6PD和TKTL1的联合抑制作用,旨在探讨共转染siRNA表达载体联合抑制PPP的效果及可行性。方法分别构建靶向G6PD和TKTL1基因siRNA干扰质粒载体,通过酶切和测序鉴定siRNA干扰质粒载体构建成功后,单独或共转染HeLa细胞株,RT-PCR检测G6PD、TKTL1 mRNA表达并结合G6PD、转酮醇酶(transketolase,TKT)活性测定判断并比较共转染联合抑制Hela细胞G6PD、TKTL1表达的效果。结果共转染靶向G6PD和TKTL1基因的siRNA干扰载体能显著下调G6PD和TKTL1基因表达水平[(0.96±0.05)vs(0.47±0.04),(0.98±0.05)vs(0.41±0.04),P<0.01]。同时,2个酶的活性也显著下降(99.2%vs34.5%和99.8%vs 40.1%,P<0.01)。共转染抑制G6PD基因mRNA表达较单独转染靶向G6PD基因的siRNA干扰载体的效果有显著下降[(0.47±0.04)vs(0.31±0.04),P<0.01)]。结论共转染siRNA干扰载体对人宫颈癌HeLa细胞PPP代谢通路进行联合抑制是一种有效的实验方案。

香鳞毛蕨1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因的克隆及表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中控制影响植物萜类化合物合成的第一个限速酶。该研究对香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans)DfDXS基因进行序列特征及生物信息学分析,并通过qRT-PCR技术分析其在外源激素、干旱、盐胁迫、高温及低温处理下的表达模式,旨在探究DfDXS基因在香鳞毛蕨萜类生物合成及抗逆机制中的作用,为进一步解析香鳞毛蕨抗逆分子机制奠定基础。结果显示:(1)DfDXS1基因全长2139 bp,编码712个氨基酸,而DfDXS2全长2160 bp,编码719个氨基酸;结构域分析显示,其具有典型的转酮醇酶保守域,包含焦磷酸硫胺素结合位点和转酮醇酶结构域;DfDXS氨基酸序列与江南卷柏(Selaginella moellendorffii)和银杏(Ginkgo biloba)的DXS等关系较近。(2)水杨酸(SA)处理下,DfDXS基因的相对表达量先升高后降低;脱落酸(ABA)抑制DfDXS的表达;DfDXS1/2在茉莉酸甲酯(MeJA)处理下相对表达水平均显著高于对照;乙烯利(Eth)抑制DfDXS的表达,但DfDXS1处理3 h时表达水平显著高于对照。(3)聚乙二醇(PEG)、高温和低温均诱导DfDXS1上调表达。研究推测,香鳞毛蕨DXS基因在萜类物质合成与逆境胁迫机制中发挥着重要的作用。

1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究

PCR和 Southern blotting检测表明 ,来自大肠杆菌的 mtl D基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。mtl D基因在 T1代出现分离 ,T2 代出现纯系。在 0 .75% Na Cl胁迫下 ,7个转基因 T3 代株系都能检测到 mtl D酶活性 ,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1 .0 % Na Cl浓度下正常生长 ,而对照在 0 .5% Na Cl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了 mtl D和 gut D两个基因的聚合 ,部分杂交后代株系能在 1 .2 5% Na Cl胁迫下正常生长结实。

假单胞菌(Pseudomonas sp. cn 4902)甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及表达

参照几种生物的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因 (mtlD)的序列设计引物 ,以极端耐盐的假单胞菌 (Pseudomonassp cn 4 90 2 )的总DNA为模板 ,采用PCR扩增、构建重组高效表达载体以及生物信息学研究等方法 ,进行基因克隆、表达及功能定性等研究。结果表明 ,克隆获得一长为 114 9bp的基因。经蛋白质保守区域研究 ,初步判别该基因为mtlD结构基因。将该基因与pBV2 2 0质粒构建成高效表达原核重组载体pBH。SDS PAGE电泳表明 ,含pBH的转化子产生特异的、分子量约为 4 1kD的蛋白带 ,表达量约占菌体可溶性蛋白 6 7%。转化子的耐盐水平比对照提高了约 1/5。在含 0 9mol/LNaCl的液体培养基中 ,转化子培养 2 4h后其生物量约是对照的 10 2倍 ,甘露醇含量约是对照的 4 1倍。可见 ,假单胞菌的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因是一个重要的耐盐相关基因 ,该基因已在GenBank登记 ,代号为AY112 6 96。

利用宏基因组文库筛选草甘膦不敏感的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶（EPSPS）基因

为探索利用宏基因组文库筛选草甘膦不敏感的5-烯醇式丙酮莽革酰-3-磷酸合酶（EPSPS）基因，直接从土壤中提取细菌DNA，构建草甘膦污染土壤细菌宏基因组文库，并利用EPSP合酶缺失突变株ER2799筛选到4个能互补EPSP合酶功能的克隆，其中两个克隆的转化子能够在含5mmol／L草甘膦的MOPS培养基上生长。测序结果表明它们均含有完整的EPSP合酶编码基因，GT-1aroA核苷酸长度为1335bp，编码445个氨基酸，GT-4aroA核苷酸长度为1350bp，编码450个氨基酸。利用PCR方法将两个基因克隆到原核表达载体pET28a上后，可以使宿主细胞BL21（DE3）在含100mmol／L草甘膦的MOPS培养基中良好生长。上述结果表明，利用宏基因组文库筛选方法可以得到高抗草甘膦的EPSPS基因。

黏蛋白16基因通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路调节胆囊癌细胞活力和迁移

目的探讨黏蛋白16基因(MUC16)是否通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路调节胆囊癌细胞(GBC-SD)活力和迁移。方法过表达MUC16后,通过Real-time PCR筛选相关基质金属蛋白酶(MMP)家族的蛋白质。其次,过表达MUC16、敲低MUC16和PI3K/Akt通路抑制剂BKM120处理后,通过免疫印迹法检测PI3K/Akt通路和MMP-9的蛋白水平。最后,过表达MUC16或敲低MUC16,通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)和刮伤实验检测GBC-SD的活力和迁移情况。结果过表达MUC16后,MMP-9 mRNA的相对表达量显著升高(P<0.05)。过表达MUC16后, MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显升高(P<0.05),但是PI3K抑制剂BKM120可以避免这现象。而敲低MUC16后,发现MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显降低(P<0.05)。过表达MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显增高(P<0.05),而敲低了MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显降低(P<0.05)。另外,敲低MMP-9后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力也明显降低(P<0.05)。但是,在过表达MUC16的同时敲低MMP-9,发现GBC-SD的细胞活力和迁移能力与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论 MUC16激活PI3K/Akt通路促进MMP-9的蛋白表达,进而提升胆囊癌细胞GBC-SD的细胞活力和迁移能力。

血红素氧合酶-1基因转染对器官移植的作用研究

血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)是体内唯一催化血红素分解代谢的限速酶,可以氧化降解血红素,将其分解为CO、Fe2+和胆绿素。HO有3种同工酶,其中HO-1是血红素降解的起始酶和限速酶,是唯一可以被诱导的HO。HO-1作为移植器官存活的关键"保护基因",通过基因转染使其稳定过表达,能显著减轻移植器官的缺血再灌注损伤,提高移植物存活率。

磷酸二酯酶基因和5-脂氧合酶激活蛋白基因多态性与脑梗死的关联性研究

目的研究磷酸二酯酶基因(PDE4D)和5-脂氧合酶激活蛋白基因(ALOX5AP)多态性与脑梗死(CI)的关联性。方法采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测PDE4D基因SNP83/SNP87位点和基因ALOX5AP的SG13S100/SG13S114位点的基因多态性,结合问卷调查结果分析基因多态性与CI的相关性。结果 CI发病流行因素包括高年龄、高血压、高胆固醇血症和心房颤动,287例CI组与300名对照组中PDE4D基因SNP83位点的C/T分布、ALOX5AP基因的SG13S100位点的A/G分布、SG13S114位点的T/A分布差异均具有统计学意义(P<0.05),SNP87C/T分布差异无统计学意义。结论 CI分布的遗传危险因素包括SNP83C/T、SG13S100A/G、SG13S114T/A三种基因位点多态性的变化。

杜仲2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶基因全长cDNA克隆与序列分析

2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶（MDS）基因曾被认为是调控植物2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径的一个关键节点.为解析杜仲MDS基因序列信息和预测基因功能,以叶片cDNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）及cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离出杜仲MDS基因的cDNA克隆,并通过一系列生物信息学方法进行序列分析.结果表明：EuMDS基因cDNA全长976 bp,5＇端非编码区长119 bp,3＇端非编码区长146bp,编码236个氨基酸.推导EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列（A1～A56）以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点（A84,A87,A89,A121,A213,A217,A221,A223,A228）.推导EuMDS蛋白二级结构中α-螺旋占40.3％,β-折叠占13.6％,螺环结构占46.2％.推导EuMDS蛋白三级结构由3个亚单位组成,并相互围绕形成1个分子内腔.系统进化分析表明EuMDS蛋白与啤酒花MDS蛋白亲缘关系最为接近.预测所克隆的EuMDS基因在杜仲萜类生物合成中发挥重要功能.

携带人血红素氧合酶-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建人血红素氧合酶-1(hHO-1)重组腺病毒,为基因治疗心肌细胞缺氧性损伤提供可能。方法:将hHO-1 cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pSGCMV,得到重组质粒pSGCMV-hHO-1。采用位点特异性重组系统(Cre/Loxp)将pSGCMV-hHO-1与腺病毒骨架载体pBHGloxP△ E3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,生成带有hHO-1基因的重组腺病毒载体Ad-hHO-1。重组腺病毒质粒在293细胞中扩增,氯化铯梯度离心纯化。结果:经酶切鉴定和测序证实载体构建的正确性,病毒滴度为2.0×1010pfu/ml。结论:成功构建带有hHO-1 cDNA的重组腺病毒,可用于对心肌细胞缺氧性损伤的基因治疗研究。

血红素氧合酶-1基因真核表达载体的构建及其在血管内皮细胞中的表达

目的克隆血红素氧合酶-1(HO-1)基因,并构建真核表达载体,建立重组HO-1蛋白的血管内皮表达细胞系。方法从大鼠脾脏中提取RNA,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆到鼠的HO-1基因,并对该基因片段进行T载体克隆、酶切鉴定和测序分析。将HO-1基因插入到真核表达载体pcDNA3中,利用脂质体介导将重组质粒转染血管内皮细胞ECV304细胞,经G418加压筛选后,对细胞进行间接免疫荧光和Western blot分析。结果DNA测序分析表明克隆的HO-1基因与文献报道一致,酶切鉴定证实基因正确地插入表达载体中。经间接免疫荧光和Westernblot表明重组HO-1蛋白在ECV304细胞中获得高效表达,其分子量约为32 kD。结论HO-1基因真核表达载体的成功构建和重组HO-1蛋白在血管内皮细胞系中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

以大肠杆菌(Escherichia coli)W3350菌株总DNA为模板,根据已报道的几种生物的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因(mtlD)序列设计引物,通过PCR扩增到1条长约1.15 kb的特异片断,把该片断连接到pUCm-T载体上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长1149 bp,共编码382个氨基酸,与报道的mtlD基因修正序列完全一致。将该基因插入到原核表达载体pET28a(+),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,发现在约45 kD处明显比对照多出1条带,凝胶扫描后经Bandscan 5.0软件分析表明,该特异条带的蛋白含量占菌体可溶性总蛋白的72.9%。Western blot检测其为带组氨酸标签的融合蛋白,而质谱分析证实其为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。转化子的耐盐能力比对照提高了约20%。该基因提交到GeneBank数据库,返回的接受号为DQ660889。

大肠杆菌Top10甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase,mtlD)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了mtlD基因(Acession numeber:EU433565)。mtlD开放阅读框为1149bp,编码含有382个氨基酸残基,分子量为41.2kD的蛋白,预测等电点为5.37。mtlD含有38个碱性氨基酸,50个酸性氨基酸,158个疏水氨基酸及72个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约60.47%的α-螺旋、4.71%的β-转角、10.73%的延伸链和20.48%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,mtlD是亲水性蛋白。亚细胞定位分析表明mtlD主要定位于细胞质中。序列分析表明大肠杆菌Top10mtlD基因与大肠杆菌W3350、大肠杆菌DEC12a和盐生盐杆菌(Halobacterium salinarum)的mtlD基因同源性分别为99%、97%和93%。大肠杆菌Top10mtlD基因的克隆及生物信息学分析为今后对mtlD的进一步深入研究奠定了基础。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶-1及乳腺癌易感基因-1在三阴性乳腺癌中的表达与意义探究

目的探讨三阴性乳腺癌(TNBC)中多腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)、乳腺癌易感基因-1(BRCA-1)表达及临床意义,为相关诊断治疗提供参考。方法选取2017年1月至2021年12月单县中心医院收治的80例乳腺癌患者为研究对象进行回顾性分析,根据是否为TNBC分为观察组(TNBC)和对照组(非TNBC),每组40例。两组患者均检测BRCA-1、PARP-1表达情况,检测方法为免疫组化法。比较两组患者检测结果,并分析观察组患者BRCA-1、PARP-1表达水平与临床参数的关系。结果观察组患者BRCA-1基因表达水平低于对照组,而PARP-1表达水平高于对照组(P<0.05);观察组患者BRCA-1表达水平与年龄、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05),而PARP-1表达水平与淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)。结论BRCA-1、PARP-1参与乳腺癌的发生及发展,TNBC患者BRCA-1表达水平低于非TNBC患者,PARP-1表达水平高于非TNBC患者,且均与淋巴结转移、TNM分期有关,临床可重点加强对淋巴结转移、TNM分期的关注。