肌钙蛋白相关蛋白对肺腺癌细胞增殖与迁移的影响及与患者预后的关系

目的探讨肌钙蛋白相关蛋白(TROAP)对肺腺癌细胞生物学功能和免疫细胞浸润的影响及与患者预后的关系。方法选取2014-01-01-2016-06-30在河北省胸科医院接受手术治疗并经病理确诊的68例肺腺癌患者癌及癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)标本为研究对象。通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库和基因表达综合数据库(GEO)分析TROAP mRNA在肺腺癌中的表达及与临床病理特征和预后的关系;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白质印迹法和免疫组织化学方法检测TROAP在肺腺癌组织和细胞株中的表达;构建TROAP干扰序列并将其转染入A549细胞中,将其分为空白对照组(Blank组)、阴性对照组(si-NC)、转染靶向TROAP的siRNA组(si-TROAP-1组和si-TROAP-2组);细胞计数盒8(CCK8)、克隆形成、Transwell和划痕实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;通过GO功能和KEGG通路富集分析TROAP在肺腺癌中的生物学功能;采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)探索TROAP表达水平与肿瘤免疫浸润的关系。结果TROAP在TCGA、GSE19804和GSE43458数据集中肺腺癌的表达水平均高于肺正常组织,t值分别为12.260、5.547和6.848,均P<0.001。TROAP表达与TNM分期(χ^(2)=11.708,P<0.001)、肿瘤大小(χ^(2)=5.968,P=0.015)和淋巴结转移(χ^(2)=18.634,P<0.001)有关联,差异均有统计学意义。肺腺癌患者预后显示,TROAP表达与患者总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)均有关联,χ^(2)值分别为13.310和10.040,P值分别为<0.001和0.002,且TROAP高表达(HR=4.724,95%CI:1.307~17.071,P=0.018)和肿瘤远处转移(HR=4.906,95%CI:1.234~19.508,P=0.024)可作为肺腺癌的独立预后因子。CCK8增殖实验结果显示,72 h时si-NC组、si-TROAP-1组和si-TROAP-2组细胞生长率分别为0.897±0.060、0.653±0.021和0.513±0.045,差异有统计学意义,F=55.510,P<0.001。克隆形成实验结果显示,si-NC组、si-TROAP-1组和si-TROAP-2组细胞克隆形成数量分别为59.330±4.040、17.330±2.517和21.000±5.292,差异有统计学意义,F=96.130,P<0.001。细胞凋亡结果显示,si-NC组、si-TROAP-1组和si-TROAP-2组细胞凋亡率分别为(12.390±1.072)%、(37.850±6.914)%和(33.520±2.275)%,差异有统计学意义,F=30.860,P<0.001。细胞划痕实验结果显示,24 h时si-NC组、si-TROAP-1组和si-TROAP-2组细胞愈合度分别为(61.790±1.524)%、(23.320±0.386)%和(23.520±1.781)%,差异有统计学意义,F=782.500,P<0.001。Transwell侵袭实验结果显示,si-NC组、si-TROAP-1组和si-TROAP-2组穿过小室的细胞数量分别为为(100.000±4.847)、(43.850±3.026)和(39.540±6.482)个,差异有统计学意义,F=137.200,P<0.001。TROAP可能参与细胞周期和DNA复制通路等过程,错误发现率<0.05,P<0.05。结论TROAP在肺腺癌中高表达与患者的不良预后相关;沉默TROAP可抑制肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和迁移;TROAP表达可能与肿瘤免疫浸润细胞相关,表明TROAP可能是肺腺癌患者预后标志物。

miR-519d-3p靶向TROAP调节Wnt/β-Catenin信号通路对非小细胞肺癌增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

目的:探究微小RNA-519d-3p(miR-519d-3p)是否靶向肌钙蛋白相关蛋白(TROAP)调节Wnt/β-Catenin信号通路影响非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。方法:RT-qPCR评估miR-519d-3p和TROAP mRNA表达;双荧光素酶分析miR-519d-3p与TROAP之间的靶向关系;Western blotting检测TROAP、β-Catenin、Axin2、C-myc的蛋白表达;集落形成实验、流式细胞术和Transwell法检测A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭;BABL/c裸鼠建立移植瘤模型,检测miR-519d-3p对体内肿瘤生长的影响。结果:miR-519d-3p与TROAP存在靶向关系(P<0.05);在体外,miR-519d-3p过表达可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。此外,miR-519d-3p过表达可下调TROAP表达并降低β-Catenin、Axin2、C-myc蛋白水平(P<0.05);TROAP过表达对A549细胞的作用与之相反(P<0.05)。同时,过表达TROAP可部分逆转miR-519d-3p过表达对A549细胞恶性行为的影响(P<0.05)。在体内,miR-519d-3p过表达可减小肿瘤体积和肿瘤重量,且显著下调Ki67和N-cadherin表达(P<0.05)。结论:miR-519d-3p靶向TROAP抑制Wnt/β-Catenin信号通路,抑制NSCLC恶性生物学行为。