低氧/低氧诱导因子-1α通过TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞上皮间质转化

目的:探讨低氧/低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人肝内胆管上皮细胞(HIBEC)上皮-间质转化(EMT)的诱导作用及其分子机制。方法:HIBEC在1%氧浓度的低氧环境中培养,分析细胞迁移、侵袭能力的变化,以及EMT相关标志E-钙黏蛋白和S100A4的表达水平。以HIF-1α的siRNA和转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂LY364947分别沉默或抑制HIF-1α和TGF-β1,再重复上述实验。结果:与常氧培养相比较,低氧条件下,HIBEC的细胞迁移和侵袭能力明显增强,上皮细胞标志物E-钙黏蛋白表达明显下降,间质细胞标志物S100A4表达明显升高(P<0.05)。以HIF-1α的siRNA和TGF-β1分别沉默或抑制HIF-1α和TGF-β1后,上述低氧引起的HIBEC生物学变化均受到明显抑制(P<0.05)。结论:低氧可以通过活化HIF-1α诱导HIBEC发生EMT,这种诱导作用主要是通过TGF-β1完成的。

淤胆大鼠肝内胆管上皮细胞原纤毛形态观察

目的:探讨在大鼠肝外淤胆模型中大胆管和小胆管原纤毛形态的变化。方法:将15只Wistar大鼠随机平分为未处理组(ratsctr)、胆管结扎7d组(ratsL7)和胆管结扎10d组(ratsL10)。用胆总管结扎法制备大鼠肝外淤胆模型。利用扫描电镜技术,比较肝内大、小胆管上皮细胞原纤毛在长度和数量上的异同。结果:ratsctr组大胆管上皮细胞原纤毛平均长度为(7.76±1.14)μm,数量为每视野(10000×)(12±3)根。胆汁淤积后,大胆管上皮细胞原纤毛长度变短:ratsL7为(2.92±1.39)μm,P<0.05;ratsL10缩短为(2.34±0.37)μm,P<0.05,数量增多:ratsL7为(87±12)根,P<0.05;ratsL10为(197±46)根,P<0.05。正常大鼠小胆管上皮细胞原纤毛的平均长度为(5.15±0.89)μm,数量为每视野(4±1)根。胆汁淤积后,小胆管上皮细胞原纤毛长度变短:ratsL7为(2.52±0.96)μm,P<0.05;ratsL10为(2.31±0.53)μm,P<0.05,数量增多:ratsL7为(16±2)根,P<0.05;ratsL10为(15±3)根,P<0.05。结论:结扎胆总管导致肝脏淤胆时,胆管上皮细胞原纤毛数量增多,长度变短。

小鼠肝内胆管上皮细胞的分离与鉴定

为建立一种简单可靠的小鼠肝内胆管上皮细胞(MIBECs)分离培养方法,用Ⅳ型胶原酶进行门静脉灌注,取出肝内胆管,用DNaseⅠ、pronase E和Ⅳ型胶原酶分类消化,小鼠肝内胆管组织细小、均匀的细胞团培养于含100mL/L胎牛血清(FBS)和10ng/mL表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素转铁蛋白硒(ITS)的DMEM/F12培养基中。细胞贴壁后,利用细胞角蛋白19免疫荧光法鉴定目的细胞。在培养的过程中,用CCK8测定细胞的生长曲线。结果显示,成功分离出MIBECs,细胞纯度约95%。细胞培养3d^7d内呈对数生长状态。以上结果表明本分离培养方法是一种简单可靠的小鼠肝内胆管上皮细胞分离纯化培养技术。

脂多糖对正常人肝内胆管上皮细胞TLR4-NF-кB通路的影响

目的探讨脂多糖(LPS)对正常人肝内胆管上皮细胞(Hi BECs)中TLR4-NF-кB通路的影响。方法 Hi BECs常规细胞培养后,加入不同浓度的LPS(0.1、1、4、8、10μg/m L),刺激不同时间(3、6、9、12、24 h),用Realtime RT-PCR分析细胞内TLR4和NF-κB mRNA表达水平。结果 LPS刺激Hi BECs后TLR4和NF-κB mRNA表达水平均增加,Hi BECs在受到LPS(4μg/m L)刺激后TLR4和NF-κB mRNA表达水平随时间延长而增加,于6小时达高峰,之后下降。以相同时间(6 h)刺激Hi BECs后,TLR4和NF-κB mRNA表达水平随LPS浓度增高而增加,LPS浓度为4μg/m L时达高峰,之后下降。结论 LPS可以激活Hi BECs中的TLR4-NF-кB通路,并且有时效和量效依赖关系。

小柴胡汤预处理对肝脏缺血再灌注损伤大鼠肝内胆管上皮细胞凋亡的影响

目的:观察小柴胡汤对肝脏缺血再灌注损伤大鼠肝内胆管上皮细胞凋亡以及胆汁中Glu、GGT、AKP水平改变的影响。方法:将大鼠36只随机分为缺血再灌注(IR)组、假手术(SO)组,小柴胡汤预处理(XP)组,肝脏缺血时间为30min,于再灌注120min末引流胆汁,取肝脏标本,观察各组大鼠胆汁中Glu、GGT、AKP水平变化,并通过原位末端标记法检测肝内胆管上皮细胞凋亡情况。结果:IR组胆汁中Glu、GGT、AKP含量均明显高于SO组(P<0.01);XP组则显著低于IR组(P<0.01)。IR组胆管上皮细胞凋亡指数(AI)明显高于SO组,差异具有高度显著性(P<0.01),凋亡细胞主要见于肝内大胆管,SO组凋亡的胆管上皮细胞罕见;XP组胆管上皮细胞凋亡指数(AI)明显低于IR组,差异具有显著性(P<0.01)。结论:肝脏缺血再灌注损伤能促进肝内胆管上皮细胞凋亡的发生,小柴胡汤预处理可减轻肝内胆管上皮细胞损伤。

CX3CL1/CCL26-CX3CR1通路在原发性胆汁性胆管炎免疫机制中的作用

目的探究CX3CL1/CCL26-CX3CR1通路在原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)免疫机制中的作用。方法收集PBC患者和健康对照者外周血及肝脏病理标本,采用ELISA检测血浆CX3CL1及CCL26水平,流式细胞术检测外周血单个核细胞各亚群中CX3CR1+细胞比例。使用免疫组化分析肝活检组织中CX3CL1和CCL26表达情况。采用ELISA和流式细胞术检测不同细胞因子及LPS刺激下,体外培养的人肝内胆管上皮细胞中CX3CL1/CCL26-CX3CR1通路表达水平变化。结果共纳入PBC患者40例、健康对照者18例。PBC患者血浆CX3CL1水平[(0.690±0.271)ng/mL]较健康对照者[(0.540±0.101)ng/ml]显著升高(P=0.044)。PBC患者血浆CCL26浓度[(8.94±4.09)pg/mL]较健康对照者[(6.75±1.86)pg/mL]有升高趋势,但无统计学差异(P=0.104)。与健康对照者相比,PBC患者CX3CR1表达水平在NKT-like细胞[(63.5±25.4)%vs.(78.6±18.0)%,P=0.026]和CD4^+T细胞[(5.5±5.4)%vs.(13.7±9.0)%,P=0.003]中显著增高,且后者这一差异在其CD28+和CD28-亚群中均显著。PBC患者肝脏胆管上皮细胞同时高表达CX3CL1和CCL26,健康对照者则弱表达CX3CL1,无CCL26表达。人肝内胆管上皮细胞CX3CL1表达水平在IFN-γ刺激下显著增加,CCL26表达在IL-4、IL-13刺激下显著增加;在IFN-γ刺激下,CX3CR1表达显著升高。结论PBC患者肝内胆管上皮细胞可能在IFN-γ刺激下CX3CL1表达增加,在IL-4和IL-13刺激下CCL26表达增加,其受体CX3CR1在外周血NKT-like细胞和CD4^+T细胞中表达上调。CX3CL1和CCL26可能通过CX3CR1协同介导PBC胆管上皮损伤。

去细胞支架材料用于胆管替代的相容性研究

目的对经去污剂处理得到的猪去细胞管腔基质支架材料用于胆管修复替代进行体外相容性研究,为该种方法制备的管腔支架材料的临床应用提供实验依据。方法采用十二烷基磺酸钠、TritonX-100处理封闭群小香猪输尿管和胆管,获得去细胞管腔基质支架材料;MTT法检测基质支架材料的不同浓度浸提液对细胞增殖的影响,并按医用生物材料细胞毒性分级标准进行评级;在基质支架材料上种植人肝内胆管上皮细胞,于接种后20d通过扫描电镜观察人肝内胆管上皮细胞在支架上的生长情况。结果经去污剂处理后的管腔支架材料与处理前相比,细胞完全去除无残留,组织结构保存完整,主要由胶原纤维构成三维立体网络状结构;支架材料细胞毒性评级为0～1级,可认为无细胞毒性;扫描电镜观察人肝内胆管上皮细胞在支架材料上贴附生长,但支架内部生长较少。结论经去污剂处理得到的猪去细胞管腔基质支架是一种无毒的天然异种管腔替代物,细胞亲和性较好,但细胞贴附时间较长,需改良细胞贴附方法。

雷公藤红素对胆管细胞的毒性作用及机制研究

目的研究雷公藤红素对人肝内胆管上皮细胞(human biliary epithelial cells,HIBEC)的毒性作用及机制。方法通过CCK-8实验及显微镜观察记录雷公藤红素对细胞形态和活力的影响;通过细胞划痕实验检测雷公藤红素对细胞迁移能力的影响;通过流式细胞术检测雷公藤红素对细胞周期的影响和对细胞凋亡的诱导作用;通过qRT-PCR和Western blotting检测雷公藤红素对凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2基因和蛋白的表达情况。结果雷公藤红素在400~2 000 nmol/L下,抑制细胞增殖,改变细胞形态;在200~800 nmol/L下,抑制细胞的迁移能力;在800~1 200 nmol/L下,出现G0/G1期阻滞作用;在400~1 200 nmol/L下,诱导细胞凋亡并增加相关基因的表达量。结论雷公藤红素可通过影响胆管细胞活力,改变其迁移能力,阻滞细胞周期并促进细胞凋亡的方式产生胆管毒性。

Uptake of bacterial lipopolysaccharide and expression of tumor necrosis factor α mRNA in isolated rat intrahepatic bile duct epithelial cells *

AIM To study the uptake of bacterial lipopolysaccharides (LPS) and expression of tumor necrosis factor α mRNA (TNF α mRNA) with cultured rat intrahepatic bile duct epithelial cells.

原发性胆汁性胆管炎免疫发病机制

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种以慢性进行性胆汁淤积为主要特征的自身免疫性肝病,针对自身抗原——丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)免疫耐受性的丧失是PBC发病的根源。肝内胆管上皮细胞特有的免疫生物学特性使其成为PBC发病的积极参与者。近年来,PBC的检出率逐年提高,但临床上仍未改变熊去氧胆酸单一用药的格局,深入了解PBC的免疫发病机制将有助于临床医师更好地预防和治疗疾病。