胶原酶灌注部分肝脏方法分离肝主质细胞

本文报导一种分离哺乳类正常肝细胞的新方法,其要点是精确安排操作的程序,在灌注前结扎肝脏的左叶和正中叶,使灌注液只在余下的1/3肝脏内流动。本方法快速、稳定,能在2小时内从大鼠的1/3肝脏(2—3克肝组织)分离出1—1.5×10~7个和肝主质细胞,存活率在95%以上。酶液(0.05%胶原酶)的用量为20～25ml,在同类实验中是最少的。

劈离式肝移植供肝体外半肝分离的技术要点(附视频)

肝移植作为挽救各类终末期肝病患者的惟一有效治疗手段已取得了巨大成功，但近年来迅速增加的待移植人群与供肝匮乏之间的矛盾日益突出，尤其是小儿供肝来源极其缺乏，导致越来越多的患者在等待中死亡。以美国为例，每年在等待肝移植的过程中死亡的患者约3000例。随着国内肝移植技术的不断发展，很多移植中心也面临着同样的问题。

原代肝细胞的分离和移植

背景:肝细胞移植可以作为一种桥梁作用,帮助肝功能衰竭患者渡过肝衰期,并提高患者生存率和预后。目的:采用Seglen改良的原位灌注探讨SD大鼠原代肝细胞分离的影响因素和方法的改进,同时分析原代肝细胞治疗急性肝功能衰竭大鼠的疗效。方法:两步法分离大鼠肝细胞。D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭,24h后分2组:细胞移植组经脾脏移植约2×107个肝细胞;对照组经脾脏注射0.4mLHank’s液。观察不同时间点大鼠的生存率和血清中转氨酶、总胆红素变化情况、脾内白蛋白分泌作用及脾内肝细胞分布情况。结果与结论:大鼠肝细胞分离存活率达85%～95%。细胞移植组14d存活率(75%)显著高于对照组组(30%)(P=0.01),且肝功能改善情况明显优于对照组。移植30d后,脾内有肝细胞白蛋白绿色荧光信号;移植15d后,可以看到肝细胞在脾脏红髓中簇集在一起并定植。结果说明胶原酶、pH值、灌注液、灌注方法等均是影响肝细胞分离存活率的因素;经脾脏移植的肝细胞能提高急性肝衰竭大鼠的生存率和改善肝功能。

改良胶原酶经腹主动脉灌注消化法分离大鼠肝细胞

背景:良好的分离技术是获取高活性肝细胞的前提。目前,国内外普遍采用的是经门静脉的两步胶原酶灌注法。但该方法仍存在胶原酶用量大、操作繁琐、流程长、对设备要求较高等问题。目的:寻找一种简单有效的大鼠肝细胞分离培养方法。方法:取SD大鼠10只,按改良经腹主动脉灌注法分离培养大鼠肝细胞,重复10次分离肝细胞实验,观察各项指标结果并与已发表文献进行对比分析。以SD大鼠作肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经腹主动脉灌注,供体肝脏肝门部结构﹑肝上及肝下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离获取肝细胞,经200目和300目筛滤过,滤过后的悬液转移至离心管中分别以1000,500,300r/min离心各3min以纯化肝细胞,以锥虫蓝染色法测细胞活性,在倒置显微镜下观察肝细胞纯度及形态变化。结果与结论:胶原酶消化法所获取的肝细胞纯度高、形态完整、活性高。提示改良胶原酶经腹主动脉灌注消化法是一种较好的肝细胞分离方法。

原代牛肝细胞分离和培养方法的建立

采用胶原酶灌注消化法，对来自新生小牛血清制备厂的牛肝脏尾状突材料进行肝细胞分离，用台盼蓝拒染法测定总细胞数和肝细胞即时存活率，以每孔1×10^4个肝细胞的量接种于牛尾胶原包被的6孔细胞培养板，进行单层培养细胞形态学观察和培养基上清液LDH活性测定。结果显示，每头小牛肝脏尾状突分离获得的细胞产量为（3．558±0．096）×10^4个，肝细胞即时存活率为（84．46±3．56）％，培养24～72h的肝细胞生长状态最好，适合用于有关肝细胞代谢、中毒、基因表达的研究。

成人原代肝细胞的分离、培养及冻存

目的:建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源.方法:20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞.选择7个不同的预培养时间点(2、6、12、24、36、48和72h),分离所获肝细胞按上述不同预培养时间在4℃人无血清培养基(HepatoZYME-SFM)中培养,然后收集预培养肝细胞转移到含100mL/L胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM中,再立即放入-80℃异丙醇冷冻盒过夜,次日投入液氮.分析比较各肝细胞在解冻后细胞活力率、贴壁率、白蛋白分泌及尿素合成.结果:在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0%±4.6%和72.0%±6.0%.4℃预培养12或24h被证明是最适预培养时间,这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点(P<0.05).与立即冷冻组相比较,预培养12或24h肝细胞解冻后活力(61.4%±4.8%,62.0%±5.6%vs53.4%±4.2%)、贴壁率(63.2%±5.8%,62.6%±3.6%vs55.2%±4.6%)、白蛋白分泌及尿素合成水平明显提高(均P<0.05).结论:人肝细胞在冷冻前4℃预培养12-24h可以获得较理想的肝细胞,为药理毒理学、生物人工肝以及细胞治疗的临床应用提供了可能性.

原代肝细胞分离培养技术现状及展望

原代肝细胞的分离和培养是建立体外HBV感染的细胞模型和临床应用生物人工肝的关键步骤,许多学者对肝细胞分离和培养技术做了大量探索.本文就近年来建立的各种肝细胞分离技术和培养技术的优缺点进行比较,并对该领域今后的发展前景作了展望.

低浓度胶原酶原位循环灌流法用于原代大鼠肝细胞分离

目的:探索高效的原代大鼠肝细胞分离方法.方法:改进并建立低浓度胶原酶原位循环灌流法,比较肝细胞产量、存活率以及胶原酶用量等.结果:低浓度胶原酶原位循环灌流法肝细胞产量为1.584±0.525×108/100g大鼠体重,存活率达95.2±2.9%,肝细胞纯度＞95%,胶原酶用量减少为4.5 mg/100g大鼠体重.而非循环门脉灌流法肝细胞产量为0.508±0.456×108/100g大鼠体重,存活率为84±8%,胶原酶用量10mg/100g大鼠体重.结论:低浓度胶原酶原位循环灌流法为一经济、高效、实用的原代大鼠肝细胞分离技术.

大鼠肝细胞分离及体外损伤模型建立

目的:分离大鼠肝细胞,建立体外大鼠肝细胞损伤模型。方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注分离大鼠肝细胞,培养液中加入不同浓度D-氨基半乳糖培养24 h,于培养1、3、6、12、24 h取上清测定ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸转移酶)、LDH(乳酸盐脱氢酶),同步测定肝细胞的细胞增殖活性(MTT)反应。结果:平均肝细胞产量(8.92±0.47)×108,Trypan blue拒染实验细胞活性率96.23%±2.41%,培养体系中加入D-氨基半乳糖后,部分肝细胞胞膜破损,随剂量增加及时间延长而逐渐加重;各剂量组随时间延长,培养上清液中生化指标水平逐渐升高,而MTT反应水平逐渐下降,以3 h与6 h变化最为明显;各时间点生化指标及MTT反应变化随剂量增加呈现相同趋势。结论:该方法可获得高产量高活性大鼠肝细胞;D-氨基半乳糖可成功诱导大鼠肝细胞体外损伤模型。

NPPB在大鼠肝细胞分离中的应用效果及其机制

目的观察5-硝基-2(3-苯丙胺)-苯甲酸(NPPB)在大鼠肝细胞分离中的应用效果,并探讨其可能的机制。方法将12只SD大鼠随机分为观察组和对照组各6只。两组分离肝细胞后,采用改良的四步胶原酶分离技术进行消化,制备肝细胞悬液。观察组在使用灌注液进行消化的过程中加入NPPB。采用血细胞计数板计算肝细胞收获量,PAS染色后计算纯度,0.4%台盼蓝染色后计算成活率。细胞无血清培养24 h后,采用全自动生化分析仪检测上层清液中的白蛋白(ALB)、ALT。采用紫外线分光光度法检测LDH吸光度,并计算LDH释放率。采用RT-PCR法检测细胞线粒体氯通道蛋白4(CLIC4)mRNA表达,Western blotting法检测细胞CLIC4蛋白表达。结果观察组与对照组肝细胞收获量分别为(4.41±0.20)×108、(4.40±0.26)×108个,纯度分别为90%±1%、89%±2%,成活率分别为88%±2%、85%±1%;两组比较,P均>0.05。观察组与对照组ALB分别为(43.8±5.0)、(25.2±3.0)g/L,ALT分别为(47.8±6.0)、(104.3±11.7)U/L,LDH释放率分别为21.0%±2.7%、34.0%±2.4%;两组比较,P均<0.05。观察组与对照组CLIC4 mRNA相对表达量分别为1.01±0.02、1.62±0.01,CLIC4蛋白相对表达量分别为0.38±0.02、0.52±0.03;两组比较,P均<0.05。结论肝细胞分离过程中应用NPPB可以在不影响分离细胞收获量、纯度及成活率的情况下,减轻肝细胞膜结构和功能损伤,其机制可能与抑制CLIC4表达有关。

三种原代大鼠肝细胞分离方法的比较

目的寻求一种高效、价廉的原代大鼠肝细胞分离方法。方法采用组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法对大鼠原代肝细胞进行分离。比较3种方法所获得的肝细胞的产率、存活率、纯度及胶原酶的用量。结果组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法所获得大鼠原代肝细胞的产量分别(0.21±0.11)、(1.87±0.51)、(1.94±0.55)×108/只大鼠;存活率分别为(54.34±8.21)%、(85.18±4.90)%、(90.34±4.46)%;肝细胞纯度分别为(68.80±10.30)%、(85.12±2.87)%、(91.84±30.3)%;胶原酶用量分别为(17.38±2.13)、(78.75±20.83)、(31.2±12.46)mg/只大鼠。结论相比于组织块法和胶原酶原位灌流法,胶原酶二步灌流法为一种经济、高效的原代大鼠肝细胞分离方法。

小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养

为分离、培养高纯度原代小鼠肝实质细胞,并鉴定其纯度及生物活性,试验采用原位两步循环灌流法及多次低速差速离心法分离纯化肝实质细胞,促贴壁培养基原代培养,台盼蓝检测其存活率,PAS反应检测其糖原合成能力,免疫荧光化学检测细胞中CK18表达情况。结果表明:每只小鼠可获取约1.5×10~6个细胞,存活率>97%;镜下发现细胞在接种后6 h开始贴壁,72 h贴壁细胞生长状态良好,胞体变大、不规则,细胞间相互靠拢呈岛状或条索状连接;肝细胞出现成片紫红色糖原颗粒,CK18在细胞中均匀分布;糖原反应联合CK18免疫荧光显示细胞纯度在90%以上。说明该试验所用方法分离出肝实质细胞数量和存活率高,促贴壁培养基培养的肝实质细胞纯度高,为细胞代谢、细胞毒性等的研究奠定了基础。

解剖分离多肝段联合切除治疗肝脏肿瘤的临床效果分析

目的评价解剖分离多肝段联合切除治疗肝脏肿瘤的临床效果。方法选入2017年2月—2018年2月该院收治的肝脏肿瘤患者60例,采用抽签法的分组形式将其平均分成实验组(n=30,解剖分离多肝段联合切除治疗)与对照组(n=30,常规的切除治疗法),分析并发症、复发与转移率、治疗效果。结果实验组中的相关效果是96.7%,对照组为70.0%,实验组并发症问题为3.3%,对照组为30.0%(P<0.05)。实验组复发率是3.3%,对照组为23.3%(χ^2=5.192 3,P=0.002 2)。实验组转移率0.0%,对照组为20.0%(χ^2=6.666 7,P=0.009 8)。实验组的并发症、复发与转移率、效果比对照组好很多,组间的数值比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在肝脏肿瘤实际治疗的过程中,采用解剖分离多肝段切除治疗法,有助于提升治疗效果,具有较高的推广优势,应予以一定重视,利用合理的方式开展相关治疗分析工作,为患者提供高质量服务。

肝细胞移植技术新进展

与传统的原位肝移植相比,肝细胞移植具有简单易行、应用灵活等优点,因而引起了临床上的广泛关注。现已证明,肝细胞移植对生物(病毒)、化学(肝毒性药物)、物理(外伤)等各种原因引起的急性肝功能衰竭起着代偿和支持作用;又可以纠正由于肝代谢酶缺陷引起的遗传性代谢疾病。微载体技术的应用和肝细胞体外转化的成功,使肝细胞作为基因治疗的受体细胞成为可能。随着介入放射学的发展,可运用经导管技术进行肝细胞移植术,对介入放射学而言,这是一极富吸引力和挑战性的新领域.

胎肝来源肝母细胞的制备方法

学术背景:在重症肝病等待肝移植过程中,应用肝母细胞治疗是可即时实施的方法之一。从胎肝中高效率的分离纯化优质细胞来源的肝母细胞具有重要的现实意义。目的:介绍制备胎肝来源的肝母细胞所涉及到的操作方法,并将这些方法横向对比,进而指出它们各自的优势与缺点,为今后实验和临床根据不同需要选择制备肝母细胞的具体方法提供依据。检索策略:应用计算机检索PUBMED数据库1997-01/2007-08有关从胎肝中分离纯化肝母细胞的文献,检索词为"fetal liver progenitor/hepatoblasts,isolation/purification",限定文章语言种类为English。同时检索CNKI数据库1997-01/2007-08有关胎肝细胞分离纯化的文献,检索词为"肝,胚胎,上皮前体细胞/肝母细胞",并限定文章语言种类为中文。另外于吉林大学图书馆查阅相应书籍及部分外文。对资料进行初审,对发表于近5年内权威杂志的文章优先考虑。排除重复研究或Meta分析类文章。共收集到245篇文献,选出其中具有代表性的介绍肝母细胞离散及分离纯化方法的文献33篇。文献评价:31篇文献中10篇文献用以介绍研究背景;5篇文献研究了胎肝细胞离散的问题;9篇文献研究了肝母细胞分离纯化的问题;7篇文献指出了该领域存在的问题及发展前景。资料综合:这些从胎肝中分离纯化出具有肝细胞和胆管上皮细胞双向分化潜能的肝上皮细胞前体细胞(又称肝母细胞),能在体外增殖并诱导分化,移植体内后显示出良好的归巢性、整合能力和再生修复功能。说明从胎肝中分离纯化肝母细胞的技术日臻完善,该领域的研究成果将有力推动以细胞为基础的肝病治疗方案在临床中的应用。结论:对各种分离纯化方法的改进和组合应用,以及新的高特异性抗原的发现有助于胎肝来源肝母细胞纯化效率的提高。

小鼠原代肝细胞糖异生研究模型的建立

目的:分离小鼠原代肝细胞并建立体外糖异生研究模型。方法:利用胶原酶两步灌注法分离并提纯小鼠原代肝细胞,彻底清除细胞内糖原,以丙酮酸和乳酸作为糖异生原料,观察胰高血糖素作用下,小鼠原代肝细胞的葡萄糖产出水平、糖代谢关键酶基因表达水平,以及cAMP-PKA信号通路的激活情况,建立小鼠原代肝细胞糖异生研究模型。结果:分离的小鼠原代肝细胞具有典型的肝细胞形态,可见双核,细胞相互接触,排列成肝索样结构。在胰高血糖素作用下,小鼠原代肝细胞糖异生葡萄糖产出量显著增加,小鼠原代肝细胞糖异生关键酶基因表达明显上调,且胰高血糖素能够促进细胞cAMP积累进而诱导PKA激活。结论:小鼠原代肝细胞分离后状态良好,能够在葡萄糖产出水平及细胞内信号通路激活上高效模拟哺乳动物机体糖异生代谢,是一项体外研究糖异生代谢的有效模型。

双能量CT虚拟铁浓度成像技术在肝铁过载中的应用研究

目的:评估第三代双源CT双能量技术虚拟铁浓度(VIC)成像应用于肝铁定量及分级的可行性和准确性。方法:腹腔内注射不同浓度的右旋糖酐铁构建肝铁过载大鼠模型,造模完成后行CT扫描和VIC图像重建,解剖取肝脏组织,用电感耦合等离子体光谱仪(ICP)定量肝铁浓度(LIC)并作为金标准。由2名放射科医师在VIC图像上勾画ROI并测量CT值,结果的可靠性用组内相关系数分析。变量间的相关性均用Spearman相关性分析评估,采用Bland-Altman比较两种方法定量LIC的一致性。根据临床铁过载治疗的分级阅值,结合ROC曲线和约登指数确定肝铁分级的最佳截断值,灵敏度和特异度,并用AUC评估分级效能。结果:ICP-LIC范围为0.32~39.21mg/g,CT值测量结果可靠(Kappa值=-0.001,P=0.807)。给药剂量和CT-VIC均与ICP-LIC有很高的相关性(ρ分别为0.91和0.98,P均小于0.0001)。VIC成像与ICP法对肝铁定量的结果一致(H0平均值=0,P=0.9859)。肝铁过载分级(1.8,3.2,7.0和15.0mg/g)的最佳截断值分别为37.65、41.45.47.05和73.40HU,各分级的AUC均超过0.95,灵敏度与特异度分别为83.3%和100%、90.9%和100%、97.2%和93.5%、100%和97.4%。结论:第三代双源CT双能量技术虚拟铁浓度成像能够精准定量肝铁浓度,同时还可对肝铁过载程度准确分级,诊断的灵敏度和特异度高。

生物人工肝:进展、难点与发展方向

1概述 生物人工肝(Bioartificial Liver)的本义是指通过组织工程技术制造的可供移植的肝脏,由于现有技术尚不能实现人造肝脏,目前所说的生物人工肝专指以培养肝细胞为基础的体外生物人工肝支持系统或装置。 生物人工肝由'肝细胞、生物反应器、辅助装置'三部分组成,关键材料是培养的具有正常活性与功能的肝细胞,核心是可供细胞培养(或放置)并能与治疗对象血循环相接的生物反应器。具体原理是将培养的肝细胞置于特殊的生物反应器内,利用体外循环装置将肝衰竭患者血液/血浆引入反应器,通过反应器内的半透膜(或直接与肝细胞接触)进行物质交换与生物作用。

胶原酶及灌流时间对大鼠肝细胞分离效果的影响

目的 研究肝细胞分离方法 ,提高肝细胞分离质量。方法 用两种质量分数均为0 .0 5 %胶原酶溶液 (Ⅰ和Ⅳ型 )经门静脉灌注肝脏 ,分离大鼠肝细胞。分别于 5、10、15min灌流肝脏 ,观察对肝细胞活率及产量的影响。将肝细胞溶液用质量分数为 0 .0 2 %胶原酶溶液孵育 10min ,观察孵育对肝细胞活率的影响。结果 Ⅳ型胶原酶消化效果明显优于Ⅰ、Ⅳ型和Ⅰ型 ,灌流 10min细胞存活率分别为 (89.5± 3 .5 ) %和 (5 8.0± 14.0 ) % ,而产量分别为 (2 .5± 0 .2 )× 10 11个 /L和 (0 .9± 0 .5 )× 10 11个 /L ,差异有非常显著性 (P <0 .0 0 1) ,细胞培养及细胞组织化学证实分离细胞的结构和功能正常。低浓度的胶原酶孵育能明显提高肝细胞的活率。结论 Ⅳ型胶原酶可获得良好的肝细胞分离效果。胶原酶孵育能提高细胞活率。