精密肝切片技术在谷胱甘肽抗氯化镉肝毒性研究中的应用

为了解精密肝切片技术应用于毒物及药物代谢体外研究的可行性 ,利用精密肝切片技术 (PCLS) ,观察毒物氯化镉 (CdCl2 )的肝毒作用及谷胱甘肽 (GSH)的拮抗效应。于最适切片与培养条件下 ,观察CdCl20 1、0 5、2 5mmol L对肝切片活力、NO分泌的影响 ,及以CYP2E1、CYP3A4为代表的I相酶和UDPGT、GST为代表的II相酶活性的变化。同时观察GSH 2 0 ,4 0 ,8 0mmol L对CdCl2 肝毒作用的逆转效应。结果显示 ,CdCl2显著降低肝切片活力 ;在 2 5mmol L时 ,CYP含量和CYP3A4活性分别较对照组降低了 4 7 6 %、6 6 0 % ,UDPGT 1、UDPGT 2和GST分别比对照组下降了 5 0 0 %、35 6 %、2 2 6 % ;而CYP2E1活性比对照组升高了75 8%。GSH 2 0mmol L时 ,CYP含量、CYP2E1、CYP3A4和UDPGT 2活性等指标接近正常水平。上述结果重复 2～ 3次变化趋势一致。提示精密肝切片培养系统用于CdCl2 肝毒作用和GSH干预效应体外研究时 ,具有稳定性和敏感性的特点。

精密肝切片技术方法学的建立

目的 :建立一种新的肝脏体外研究手段———精密肝切片技术 ,摸索最佳培养条件。方法 :利用国产振荡切片机 ,制备肝切片 ,建立培养系统 ,以乳酸脱氢酶外漏、谷胱甘肽含量、噻唑蓝还原能力、蛋白含量为指标 ,观察切片厚度、培养液pH值及培养时间对肝切片活力的影响 ;观察抗氧化剂谷胱甘肽 (GSH)、阿魏酸钠 (SF)对CCl4 损伤肝切片活力的影响。结果 :切片厚度 30 0 μm ,培养液pH7.0时 ,肝切片在 4h内活力维持良好。GSH可恢复CCl4 所致肝切片多项指标的变化 ,SF也有一定逆转作用。结论 :精密肝切片技术可用于肝体外研究。切片厚度 30 0 μm ,培养液pH7.

醋氨酚所致精密肝切片损伤模型的建立及CYP2E1的调节作用

目的:利用精密肝切片(PCLS)技术,建立醋氨酚所致肝切片损伤的体外模型,并探讨CYP2E1活性变化对肝损伤的调节作用,为研究和筛选肝保护药物提供实验依据。方法:利用振荡切片机制备PCLS,建立培养系统。将终浓度为500μmol/L的醋氨酚分别与切片共孵育0、2、4、6h,测定培养基和切片中的谷胱甘肽S-转移酶(GST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。在体给予不同剂量(0.25、0.5、1.0g/kg)的CYP2E1诱导剂乙醇,每天一次,连续3d。末次给药8h后处死动物,取其肝脏制备PCLS,再与500μmol/L醋氨酚共同孵育6h,检测ALT和LDH漏出率。正常PCLS与不同浓度的二乙基二硫代氨基甲酸酯盐(DDTC,CYP2E1抑制剂)(5、10、20μmol/L)、500μmol/L醋氨酚共同孵育6h,检测ALT和LDH漏出率。结果:与常规培养组比较,醋氨酚孵育4、6h组的GST和LDH漏出率显著升高(P<0.01)。与醋氨酚模型对照组比较,乙醇中、大剂量组LDH漏出率和小、大剂量组ALT漏出率皆升高(P<0.01,P<0.05);DDTC各浓度组ALT漏出率则降低(P<0.05)。结论:PCLS与500μmol/L醋氨酚共孵育4h即能成功地建立体外肝切片损伤的模型。抑制CYP2E1活性可能对醋氨酚所致的肝损伤有保护作用,而上调CYP2E1活性则可能加重醋氨酚所致的肝损伤。

阿魏酸钠对乙醇损伤性大鼠肝切片的保护作用及机制

目的:采用精密肝切片技术,研究阿魏酸钠(SF)对乙醇损伤性大鼠肝切片的保护作用及机制。方法:制作大鼠乙醇损伤肝切片模型,观察不同浓度SF对切片培养液中肝损伤标志酶及胞浆苯胺羟化酶(ANH)、乙醇脱氢酶(ADH)活性的影响。结果:乙醇50mmol·L-1作用肝切片4h时,培养液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和谷胱甘肽S-转移酶活性明显升高,同时肝切片胞浆ANH活性升高、ADH活性降低。当共处理SF463~1388nmol·L-14h后,培养液中各酶活性显著降低至正常水平,SF浓度增至694nmol·L-1以上时,肝切片胞浆ANH和ADH活性也恢复正常。结论:SF能有效拮抗乙醇所致的肝损伤,其机制与改变乙醇代谢途径有关。

精密肝切片技术在药物研究中的应用

精密肝切片是近年来迅速得到广泛应用的一种体外研究方法。该技术是介于器官与细胞水平之间的体外培养技术,可包含肝组织内的所有类型的细胞,保存完好的组织结构。在一定的程度上模拟了体内的肝环境,有利于观察细胞基质和细胞间的相互作用和外源性物质的代谢情况,可同时观察代谢酶的区域性分布和肝脏中各类型细胞的相互作用。此外在毒理学方面可以通过检查培养基中酶含有量的变化,结合肝切片的病理变化和免疫组化等技术,研究肝毒性的特点和机制。本文对精密肝切片的特点及其在药物代谢、毒理学应用等方面进行综述,以供药物研究参考。

CCl4诱导的建鲤精密肝切片损伤模型的构建及CYP1A对肝损伤的影响

为了评价CYP1A在四氯化碳(CCl4)诱导的建鲤(Cyprinus carpio.Jian)急性肝损伤中的作用,利用精密肝切片(precision-cut liver slices,PCLS)技术,构建了CCl4诱导的建鲤精密肝切片体外损伤模型。研究中通过测定精密肝切片的增值活力、生化指标、肝组织中CYP1A的m RNA表达水平来探讨CYP1A对肝损伤的调节作用。研究结果显示,4~24 mmol·L^-1 CCl4作用4 h后,建鲤精密肝切片培养上清液的谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)含量升高,切片匀浆中和丙二醛(MDA)大量产生,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平下降,其中,浓度为12mmol·L^-1的CCl4,损伤4h,肝切片的活力维持在65%以上,可以作为造模的条件;75μmol·L^-1α-萘黄酮作用精密肝切片6h后,肝组织中CYP1A的m RNA表达被显著抑制,生化指标显著改善。研究结果表明,CYP1A与CCl4诱导的建鲤肝损伤关系密切,抑制CYP1A的表达可能对肝损伤有保护作用。

吲哚-3-原醇对乙醇损伤性大鼠肝切片的保护作用

目的 采用精密肝切片技术 ,研究十字花科类蔬菜提取物吲哚 3 原醇 (I3C)对乙醇肝损伤的作用及机制。方法 制作大鼠乙醇损伤肝切片模型 ,观察不同剂量I3C对培养液中肝损伤标志酶及肝细胞浆苯胺羟化酶 (ANH)、乙醇脱氢酶 (ADH)活性的影响 ,并进行组织学检查。结果 乙醇5 0mmol·L-1作用肝切片 4h时 ,培养液谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和谷胱甘肽S 转移酶活性明显升高 ,同时肝细胞浆ANH活性升高、ADH活性降低 ;加入 10 0～ 4 0 0μmol·L-1的I3C后 ,培养液中各酶活性降低的同时 ,肝细胞ANH和ADH活性恢复正常。肝切片病理学检查也证实I3C的保护作用。结论 I3C能有效拮抗乙醇所致的肝损伤 ,其机制与改变乙醇代谢途径有关。

猫体华支睾吸虫肝切片标本制作的体会

有关猫体华支睾吸虫肝组织标本制作的报道较少,为了夺实验教学中让学生观察华支睾吸虫之肝组织的病理变化,作乾于2004年5月在华支睾吸虫流行区江西省信丰县大塘购买了一条重度感染华支睾吸虫的病猫,制作警备体华支睾吸虫肝组枳切片标本,现将标本制作过程和体会报道如下.

肝切片技术及其在药物毒物代谢和毒理学研究中的应用

由于 Krumdieck组织切片机的问世和动态培养体系的发展 ,使精密肝切片技术在药理学和毒理学中的应用日益广泛 ,尤其在药物代谢研究中有着其他体外方法 (肝细胞培养、器官灌流、微粒体制备 )所不具备的许多优点。本文介绍了肝切片的技术、制备、培养系统、特点以及在药物毒物代谢和毒理学研究中的应用。

利用地塞米松构建建鲤肝切片脂变模型

用地塞米松构建建鲤肝切片脂变模型,并探索最佳建模浓度,初步探究地塞米松致建鲤肝脏脂变的作用机理。建鲤活体取肝,用振荡切片机制备厚度为300μm的建鲤肝切片,27℃培养箱中预培养2 h。将试验分为试验组和空白对照组,试验组用含浓度为0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L地塞米松的L-15培养基于27℃培养箱中培养12 h,空白对照组用L-15培养基培养相同时间,培养结束后,收集试验组和空白对照组中上清液和肝切片。参照试剂盒说明检测上清液中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性,肝切片匀浆中三磷酸腺(ATP)、总蛋白(TP)含量,甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)含量以及脂肪酸合成酶(FAS)活性。结果显示,建鲤肝切片经地塞米松诱导后,ATP含量变化不大;当地塞米松浓度为3.93 mg/L时,试验组的其他指标与空白对照组差异极显著(P<0.01)。由此说明,用浓度为3.93 mg/L地塞米松诱导建鲤肝切片12 h可以成功构建建鲤肝切片脂变模型。

吲哚-3-原醇对乙醛所致精密肝切片中星状细胞活化的影响

目的利用精密肝切片(PCLS)技术,研究吲哚-3-原醇(I3C)对乙醛活化肝星状细胞(HSCs)的作用及其机制。方法将200～800μmol.L-1的I3C及700μmol.L-1乙醛与PCLS共同孵育6h,免疫组化法分析肝切片中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,并检测培养液中谷胱甘肽S-转移酶(GST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性、转化生长因子-β1(TGF-β1)含量、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)表达量及组织丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(Hyp)含量。结果200～800μmol.L-1I3C可不同程度的减少乙醛激活的HSCs,并可明显降低乙醛升高的培养液中GST、LDH活性和肝组织中MDA和Hyp含量(P<0.05或P<0.01),呈良好的浓度依赖性。I3C给药组与乙醛对照组比较,培养液中TGF-β1含量降低(P<0.01),MMP-1/TIMP-1蛋白表达比值升高(P<0.01)。结论I3C能有效拮抗乙醛所致的HSCs活化,其机制与降低细胞氧化应激和促进基质胶原降解有关。

精密肝切片中乙醛活化肝星状细胞模型的建立

目的:在精密肝切片中利用乙醛激活肝星状细胞,建立一种星状细胞激活的体外模型,为研究和筛选阻抑肝纤维化发生的药物奠定基础。方法:利用振荡切片机制备精密肝切片,建立培养系统。以700μmol·L-1乙醛孵育切片,培养0、2、4、6h,测定培养基和组织匀浆中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、乳酸脱氢酶(LDH)和羟脯氨酸(Hyp)含量,观察病理切片中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果:与0h相比,乙醛培养2、4、6h培养基的GST、LDH漏出量均显著升高(P<0.05)。切片组织Hyp含量6h较0h相比明显升高(P<0.05)。免疫组化片镜下可见4、6h有α-SMA阳性细胞表达,图像分析显示面积和阳性率较0h明显增加(P<0.05)。结论:精密肝切片与终浓度为700μmol·L-1乙醛共孵育6h可活化切片中星状细胞,该技术可作为良好的体外肝星状细胞激活模型。α-SMA免疫组化是一鉴定体外星状细胞激活的可靠指标。

甘草提取物对2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英致建鲤精密肝切片组织损伤中生化指标及免疫功能的影响

利用精密肝组织切片来评价甘草提取物对2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英(TCDD)诱导建鲤精密肝切片损伤的保护作用,将制备的肝组织切片分为6个处理组,即Control组、TCDD模型组、甘草提取物对照组、甘草提取物前处理组、甘草提取物后处理组、甘草提取物前后处理组,其中甘草提取物前处理组、甘草提取物后处理组、甘草提取物前后处理组分别换用含0.2、0.4、0.8 mg·m L-1的甘草提取物L-15培养基与精密肝切片共培养,用于检测损伤肝切片培养液中丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、免疫球蛋白M(Ig M)的含量变化,结果表明:前处理组甘草提取物可以较好缓解TCDD对肝组织造成的损伤,降低了肝切片培养液中GOT、GPT活性以及MDA、TNF-α、IL-1β、Ig M含量,提高了培养液中SOD活性。这说明甘草提取物可以有效抑制TCDD造成的肝组织损伤,对肝组织具有明显的保护作用。

基于精密肝切片技术的野百合碱体外肝毒性初步研究

目的:对精密肝切片技术进行实验条件的优化,并依此技术对野百合碱的体外肝毒性进行初步的研究探讨。方法:利用震荡切片机制备肝切片,通过对培养液、切片厚度、pH及不同培养温度等条件下,肝切片MTT还原能力的测定,建立肝切片培养技术,并将肝切片与野百合碱共培养,连续监测法测定GPT,GOT,LDH,GGT酶活浓度,BCA法测定蛋白含量,观察其对肝切片MTT还原能力及以上生化指标的影响。结果:精密肝切片厚度在200μm,pH 6.8,37℃,BPM培养液中肝切片MTT还原能力最强;野百合碱0.02,0.1,0.5 g.L-1与肝切片共培养24 h,LDH漏出率显著上升,蛋白含量显著下降;野百合碱3个剂量组与肝切片共培养6 h,对MTT还原能力及生化各项指标无明显影响。结论:大鼠精密肝切片在BPM培养基的优化培养条件下,MTT还原能力可维持24 h;野百合碱0.02,0.1,0.5 g.L-1与肝切片共培养24 h,显示出一定的肝脏毒性。

大鼠肝纤维化精密切片技术的建立

目的 :建立肝纤维化精密切片技术 ,摸索最佳体外培养条件 ,用于体外肝脏异物代谢和药物相互作用研究。方法 :建立大鼠复合因素 (高脂、酒精和CCl4)肝纤维化模型 ,制备肝纤维化状态下的肝切片 ,建立培养系统 ,以培养基中乳酸脱氢酶 (LDH)漏出量、肝组织中谷胱甘肽S 转移酶 (GST)活性、肝细胞噻唑蓝 (MTT)还原能力为指标 ,观察切片厚度、培养液pH值和培养时间对肝切片活力的影响。结果 :大鼠经复合因素处理后 ,3周即可造成肝纤维化早期病理改变。在切片厚度 30 0 μm、培养液pH 7.0的条件下 ,肝切片在 6h内能够维持最低的LDH漏出量和最高的GST活性、MTT还原量。结论 :肝纤维化状态下的精密肝切片技术 ,其切片厚度30 0 μm、培养液pH 7.0、培养时间 6h时为最佳培养条件。

精密肝切片技术在肝纤维化研究中的应用研究进展

精密肝切片（precision-cutliverslice，PCIS）技术是一种介于器官与细胞水平间的肝脏体外实验技术，由于其切片技术相对简单，无需使用胶原酶，且能够较完整保存正常组织结构、细胞联系及细胞极性（polarityofhepaticcell），因而能最大限度地模拟在体状态，目前已广泛应用于药物（或毒物）代谢、氧化应激、种属间药物作用差异等方面的研究.近年来，PCLS技术因其在研究肝星状细胞（HSC）激活和肝纤维化方面的潜在应用价值而受到愈来愈广泛地关注。