肝癌细胞系中circAMOTL1的表达及对肝前体细胞增殖和恶性转化的影响

目的探讨环状RNA circAMOTL1在肝癌细胞系中的表达及其对肝前体细胞(HPCs)系WB-F344的增殖迁移及恶性转化的影响。方法通过实时荧光定量PCR检测circAMOTL1在5种肝癌细胞系和正常肝细胞系L-02以及HPCs系WB-F344中的表达;同时构建过表达和敲除circAMOTL1的WB-F344的细胞系;通过CCK-8实验检测过表达或敲除cAMOTL1后HPCs的增殖变化;细胞划痕实验验证细胞迁移的变化;通过蛋白免疫印迹实验验证过表达或敲除circAMOTL1后对肝癌干细胞(LCSCs)标志物CD133的表达影响。结果5种肝癌细胞系中circAMOTL1的表达水平均高于L-02(P<0.05);过表达circAMOTL1后HPCs的增殖能力显著提高(P<0.01),敲除circAMOTL1后细胞的增殖能力显著下降(P<0.001);过表达circAMOTL1后显著提升了细胞的迁移能力(P<0.01),敲除后细胞的迁移能力明显下降(P<0.01);过表达circAMOTL1后可以检测到CD133的表达。结论circAMOTL1在5种肝癌细胞系中高表达,过表达circAMOTL1可以促进HPCs的增殖和迁移能力,诱导其向LCSCs方向恶性转化。

TIPS治疗术后肝前性门静脉高压难治性消化道出血1例

患者男性,53岁,2020年11月因肝门胆管癌(Ⅲb型)于外院行左半肝切除术及胆管空肠吻合术。病理:中-低分化腺癌。术后出现胆汁瘤合并感染。2021年5月因“发热伴呕血”就诊于外院。血红蛋白(HGB)41 g/L,增强CT:肝脓肿,脾大,食管胃静脉曲张(gast-roesophageal varices,GOV),见图1。2022年2月因“黑便”再次就诊。胃镜:GOV较前加重,见图2。

表达HBx的肝前体细胞的小鼠肝内移植模型的构建

目的构建表达乙肝病毒X基因(HBx)的肝前体细胞,并经小鼠门静脉注射建立肝内移植模型,为进一步研究HBx对肝前体细胞的作用和影响及其在原发性肝癌发病机制中的作用奠定了基础。方法分别将表达HBx基因的重组腺病毒Ad-HBx-GFP和空载体Ad-GFP转染小鼠肝前体细胞,再经小鼠门静脉注射后3、7、14 d取血清和肝组织,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)变化情况,观察绿色荧光蛋白表达情况,免疫组织化学法观察HBx阳性染色,并取表达高峰在第7天的肝组织,进行Western blot法和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法分别检测HBx的蛋白及mRNA表达。结果成功构建了表达HBx并靶向针对肝前体细胞的小鼠模型,绿色荧光蛋白表达量、免疫组化阳性细胞数量及血清ALT均在注射后第7天达到高峰,RT-PCR及Western blot均检测到第7天14-19/Ad-HBx-GFP组小鼠肝组织目的基因及蛋白的特异性表达,与14-19/Ad-GFP组及生理盐水注射组相比结果具有统计学差异。结论成功构建了表达HBx并靶向针对肝前体细胞的小鼠模型,操作可靠,重复性好,效果稳定,不仅对探讨原发性肝癌的发生机制奠定了基础,也为肿瘤动物模型的构建提供了新的思路。

稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响

目的构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组。MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达。结果 RT-PCR和Westernblot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P<0.05);G1细胞比例明显减少(P<0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P<0.05);cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P<0.05);GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P>0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。结论成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖。

小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究

目的将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的C57/BL6小鼠脾脏,检测HPCs在小鼠脾脏内分化和移植细胞的功能及其在脾脏组织中的整合情况,探讨肝细胞合适的替换治疗细胞来源。方法体外培养ESC并制备拟胚体(EBs),体外诱导EBs 18 d后得到HPCs,然后用Hochest 3342荧光标记HPCs并制备成6.0×107/m l细胞悬液。移植受体小鼠用2乙-酰氨基芴(2-AAF)处理,移植前受体鼠经过7 Gy60Coγ全身辐照和50%肝脏切除,造成小鼠体内对肝细胞的极大需求;然后将0.1 m l含6.0×106HPCs细胞悬液经尾静脉注射移植入脾脏,细胞移植4周后,检测移植细胞在小鼠脾脏整合分化情况。结果体外培养ESC并制备出EBs,EBs经体外诱导为HPCs,并将HPCs移植到小鼠脾脏,4周后观察到移植细胞能够嵌合到受体脾脏组织,在脾脏组织中未形成畸胎瘤,并且移植细胞能表达肝细胞较特异标志物白蛋白、CK19和糖原PAS染色呈阳性反应。结论本实验建立一种将体外ESC诱导的HPCs移植并整合到脾脏的细胞移植技术,为研究肝细胞分化的分子机制和肝病的细胞替换治疗提供基础。

HBx诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)能否诱导肝前体细胞(HPCs)发生上皮-间质转化(EMT)。方法将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,经稻瘟菌素(blasticidin)筛选,获得稳定表达HBx的HP14.5细胞。观察其形态变化,通过实时定量PCR(real time-PCR)及Western blot法检测其间质细胞标志物和上皮标志物在mRNA和蛋白水平的表达量,并采用划痕实验检测其细胞迁移能力的变化。结果 HP14.5细胞稳定表达HBx蛋白后细胞由多角形变为长梭形;与对照组相比,神经钙黏素(N-cadherin)、Snail、vimentin的mRNA和蛋白水平表达均升高,具有统计学差异(P<0.05)而上皮性钙黏素(E-cadherin)、细胞角蛋白18(CK18)的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05;同时其迁移能力显著升高(P<0.05)。结论 HBx能诱导肝前体细胞发生EMT,并增强其迁移能力。

Wnt3诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化

目的探讨wnt3对小鼠肝前体细胞(14-19)发生上皮-间质转化的影响。方法分别将空载体Ad-GFP和表达wnt3的腺病毒Ad-GFP-wnt3转入小鼠肝前体细胞中,显微镜下观察细胞形态变化。细胞划痕实验和细胞迁移实验观察14-19细胞迁移能力。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹分析分别检测14-19细胞中上皮标记物和间质标记物的表达改变。结果显微镜下可见高表达wnt3的14-19细胞由不规则多边形变为长梭形。细胞划痕实验和细胞迁移实验结果显示,高表达wnt3的14-19细胞迁移能力明显提高,与空载体转染细胞相比差异具有统计学意义(P<0.01)。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示,间质标记物N-cadherin、vimentin和twist1的mRNA和蛋白水平表达上调,相反上皮标记物E-cadherin的mRNA水平和蛋白水平表达下调,与空载体转染细胞相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 Wnt3能够促使小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化,提示其可能参与了肝纤维化的发展进程。

影响肝前体细胞增殖分化的因素研究

对影响肝前体细胞增殖分化的因素进行初步探讨。采用免疫组织化学 (IHC)的方法分别对 5 9例重型肝炎 (SH)病例肝组织标本表达干细胞因子受体 (c -kit)、谷胱甘肽S转移酶π(GST -π)、细胞角蛋白 19(CT - 19)、细胞角蛋白 18(CT - 18)、增殖细胞核抗原 (PCNA)及一些细胞因子如白细胞介素 - 18(IL - 18)、一氧化氮合酶 (NOS)和转化生长因子 - β1(TGF - β1)的情况进行检测。重型肝炎中肝前体细胞主要以管状细胞和小肝细胞样细胞的形式存在。IL - 18可在少数管状细胞弱表达 ;NOS在枯否细胞、肝细胞、管状细胞和小肝细胞样细胞中均有很好的表达 ;而TGF - β1在管状细胞罕见表达。在人重型肝炎后肝细胞再生过程中肝前体细胞主要是管状细胞和小肝细胞样细胞 ,一些细胞因子可能参与了这些细胞的活化、增殖和分化过程 ,如IL - 18和NO ;而TGF -

慢性乙型肝炎组织中肝前体细胞的免疫组化特征

目的研究肝前体细胞(hepatic progenitor cells,HPCs)、小管样反应、中间型肝细胞在慢性乙型肝炎组织中的分布特征和数量变化,以及与肝细胞再生之间的可能联系。方法对42例慢性乙型肝炎组织行常规病理HE染色,按炎症活动度(G)分为轻、中、重三度,免疫组织化学方法观察肝胆细胞标记(AFP、GST-π、CK7、CK19)和造血干细胞标记(c-kit、CD34)的表达,并以Ki-67标记增殖的肝细胞,用CK7/CK19作为标记物对符合定义的HPCs、中间型肝细胞进行计数,小管样反应程度的判定利用彩色病理图象分析系统。结果慢性乙型肝炎的早期阶段即存在HPCs的活化和小管样反应,其数量随着炎症活动度的增加而增加,均表达CK7、CK19、GST-π和AFP,肝细胞增殖指数在轻、中度肝炎中逐渐增加,重度肝炎、肝硬化患者增殖的肝细胞数下降,而中间型肝细胞数量显著增加。小管样反应面积百分比与HPCs数目正相关(r=0.739,P<0.05),中间型肝细胞数目与HPCs数目正相关(r=0.614,P<0.05)。结论慢性乙型肝炎中不仅有成熟肝细胞增殖,也存在肝前体细胞活化和分化,可能参与肝脏损伤后的再生修复。

肝前型门静脉高压症的诊治

目的探讨肝前型门静脉高压症的临床特点、诊断、治疗方法的选择及疗效。方法回顾性分析第二炮兵总医院及北京协和医院2000年1月至2009年5月期间收治的46例肝前型门静脉高压症(包括2例Abern-ethy畸形)患者的临床资料。全部患者均根据间接门静脉造影、CT血管造影和(或)彩超检查结果确诊为肝前型门静脉高压症。行肠系膜上静脉-下腔静脉分流术23例;脾切除、脾静脉-肾静脉分流术8例;门静脉-下腔静脉分流术1例;附脐静脉-颈内静脉分流术2例;门奇静脉断流术3例;脾切除、门奇静脉断流术1例;乙状结肠暂时性造瘘,6个月后闭瘘1例;大部分小肠切除术1例;经股动脉插管溶栓4例;未行手术2例,仅给予护肝及对症治疗。结果44例患者随访2个月～5年,平均23.4个月,1例未手术者失访。34例行分流手术治疗的患者术后脾功能亢进症状消失,未再发生上消化道出血;行断流术者术后13个月及2年因再次出血行肠系膜上静脉-下腔静脉分流术2例;断流术后8个月因再次出血死亡1例;溶栓治疗后40d因肠坏死死亡1例,1例未手术的患儿出院4个月后再次出现黑便经保守治疗好转。结论肝前型门静脉高压症的治疗以降低门静脉压力为主,各种分流手术及肠系膜上动脉和(或)脾动脉置管溶栓安全有效,但需根据个体情况施行。

异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠

背景:成体肝前体细胞可在受体肝脏内定植并分化为肝细胞。不过,异种肝前体细胞移植能否促进急性肝损伤的恢复,脾脏微环境能否促进移植物的存活和向肝细胞分化,尚没有研究。目的:评价异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤的作用;监测移植肝前体细胞在大鼠脾脏实质内的定植及向肝细胞的分化。方法:体外培养雄性小鼠来源的肝前体细胞系肝上皮样前体细胞。通过CCl4腹腔注射联合2/3肝切除构建急性肝损伤大鼠模型,进行肝上皮样前体细胞脾脏移植。在肝切除后1,5,14和21 d,苏木精-伊红染色观察肝脏病理改变,全自动生化分析仪监测血清转氨酶变化,PCR反应检测脾脏组织Y染色体特异性序列Sry,脾脏CK-19和Alb免疫组织化学追踪移植肝上皮样前体细胞的植入和肝细胞分化。结果与结论:肝上皮样前体细胞可在体外长期培养,保持增殖能力和双向分化潜能。肝上皮样前体细胞脾脏移植后,肝损伤大鼠肝细胞肿胀明显减轻,丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶下降更明显。移植后1,5,14和21 d,脾脏DNA中均能检测到Sry序列。在整个实验期间CK-19阳性细胞在大鼠脾脏实质内始终存在。Alb阳性细胞在移植后5 d在脾脏实质中出现,随后阳性细胞数逐渐增多。实验表明,移植肝前体细胞能在大鼠脾脏实质中植入,并分化为肝细胞,能有效促进CCl4腹腔注射联合2/3肝切除诱导的大鼠急性肝损伤的修复过程。

中青年女性肝前脂肪厚度与腹腔内脂肪厚度及肥胖人体测量值的相关性研究

目的探讨应用超声检测中青年女性肝前脂肪厚度与腹腔内脂肪厚度及肥胖人体测量值的相关关系。方法对330例18～47岁中青年女性采用超声检测肝前脂肪厚度和腹腔内脂肪厚度,并测量身高、体重、腰围、臀围等肥胖人体指标,分析肝前脂肪厚度与腹腔内脂肪厚度及人体有关测量值的相关关系。结果直线相关分析显示肝前脂肪厚度与腹腔内脂肪厚度呈正相关关系(P<0.05),与体重、体质量指数、腰围、臀围、腰臀比等肥胖人体测量值呈正相关关系(P<0.05),而与身高无明显相关关系(P>0.05)。结论 18～47岁女性肝前脂肪厚度与腹腔内脂肪厚度及肥胖有关人体测量值呈正相关关系,超声检测肝前脂肪厚度在临床应用中有简单、精确、实用的优点。

过表达Wnt3基因抑制肝前体细胞凋亡

目的利用腺病毒载体转染体外培养的肝前体细胞,研究过表达Wnt3对肝前体细胞凋亡的影响。方法用携带Wnt3的腺病毒载体(Ad-Wnt3)转染肝前体细胞,同时设立空载体腺病毒转染组(Ad-GFP)为对照。转染72 h后,用荧光显微镜观察Hoechst33342染色后细胞凋亡情况;流式细胞术检测Annexin-PE/7-ADD法标记的细胞凋亡率;RT-PCR和Western blot分别检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平。结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3在肝前体细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3能高效转染肝前体细胞。与对照组相比较,肝前体细胞转染Wnt3后,肝前体细胞的凋亡水平明显下降,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。Bax的mRNA及蛋白表达水平则明显下降(P<0.05)。结论在肝前体细胞中,Wnt3基因过表达能抑制肝前体细胞凋亡,其机制可能是通过Bcl-2家族起作用。

外源性HBx在昆明小鼠体内促进肝前体细胞上皮间质转化

目的构建靶向作用于小鼠肝前体细胞的动物模型,研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝前体细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法每周2次给予昆明小鼠2 m L/L四氯化碳灌胃,4周后行经门静脉注射稳定表达HBx的肝前体细胞和稳定表达空载体的肝前体细胞同时切除部分肝脏。术后继续每周2次进行灌胃,并分别于术后3、5、7、14、21、28 d,处死小鼠取肝脏标本;实时定量PCR检测小鼠肝组织HBx的mRNA水平、免疫组织化学染色检测肝组织中外源性细胞的存活。实时荧光定量PCR检测上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和细胞角蛋白18(CK18)mRNA水平,Western blot法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin、CK18蛋白水平。结果免疫组织化学染色结果显示,术后肝脏组织明显有外源性细胞存活.随注射时间延长,肝组织HBx的含量增加,表达区域增大;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示过表达HBx能够使小鼠肝组织中E-cadherin、CK18水平降低,而N-cadherin、vimentin的水平增加。结论动物模型证实HBx在肝前体细胞EMT过程中起着重要的调控作用。

中年肥胖人群肝前脂肪厚度的超声测量与血清甘油三酯的相关性研究

目的:探讨应用超声检测中年肥胖人群肝前脂肪厚度与血清甘油三酯的关系。方法:对129例30-50岁间的体重指数BMI大于26的人群采用超声检测肝前脂肪厚度,分析肝前脂肪厚度与血清甘油三酯的关系。结果:分析显示肝前脂肪厚度与血清甘油三酯呈正相关,与体重指数没有相关关系,男性与女性肥胖人群肝前脂肪厚度及血清甘油三酯具有统计学差异。结论:超声检测肝前脂肪厚度在评估肥胖人群的心血管代谢性疾病危险因素方面有显著作用。

肝前体细胞生物学特性及调控机制的研究进展

肝前体细胞(HPCs)是肝脏内具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞,不仅与肝脏再生修复密切相关,也与原发性肝癌发生、发展密切相关。本文简要总结了近几年有关肝前体细胞的生物学特性、来源、定位以及多种信号调控通路在其增殖、分化及形成肿瘤中的作用等研究进展。

老年肝前型门静脉高压症诊治分析

目的探讨老年肝前型门静脉高压症(prehepatic portal hypertension,PPH)的临床特点和治疗策略。方法回顾分析15例PPH患者的诊治过程,结合国内外文献,总结治疗经验。结果彩色多普勒超声及门静脉间接造影检查确诊,5例有典型门静脉海绵样变(cavernous transformation of the portal vein,CTPV)表现,5例为门静脉血栓形成,1例卵巢癌、2例胃体癌转移压迫脾静脉,2例因胃窦癌肝门转移压迫门静脉主干。行门体断流术8例,肠腔分流术2例,内镜下曲张静脉硬化剂注射(endoscopic sclerotherapy,EVL)及结扎治疗(endoscopic sclerotherapy,EST)5例,平均随访(23.4±6.1)个月,死亡8例。结论老年PPH病因复杂,肿瘤压迫脾静脉或门静脉主干占较大比例。诊断主要依靠彩超及门静脉造影,治疗方案根据患者个体情况而定。

超声检测女性肝前脂肪厚度与内脏脂肪厚度的相关性研究

目的探讨超声检测肝前脂肪厚度与内脏脂肪厚度的关系。方法对101例女性行超声检测,测量剑突下肝前脂肪厚度及脐上1 cm处内脏脂肪厚度,分析两组测量值间的关系。结果女性肝前脂肪厚度明显小于内脏脂肪厚度[(9.35±4.21)mmVS(23.48±10.95)mm],两者呈正相关(r=0.722,P=0.000)。结论超声检测女性肝前脂肪厚度与内脏脂肪厚度有良好的相关性,是测量内脏脂肪的更简单实用的方法。

PCOS患者判断肥胖人体测值与肝前脂肪厚度的相关性研究

目的探讨PCOS有关肥胖人体测量值与肝前脂肪厚度的关系。方法对217例PCOS患者测量身高、体重、腰围、臀围等判断肥胖的人体测量指标,并用超声检测肝前脂肪厚度,分析上述人体测量值与肝前脂肪厚度的关系。结果相关分析显示体质量指数(BMI)、腰围、臀围、腰臀比(WHR)等判断肥胖的人体测量指标与肝前脂肪厚度均呈正相关(P<0.05)。结论 PCOS患者有关肥胖人体测值与肝前脂肪厚度存在正相关,而超声检测肝前脂肪厚度更为直观、精确。