肝受体同源物-1通过转录激活多药耐药基因1调控肝癌细胞对奥沙利铂的敏感性

目的探索肝受体同源物-1(the liver receptor homolog-1,LRH-1)在调控肝癌细胞对奥沙利铂敏感性过程中的功能和分子机制,为肝癌治疗提供新思路。方法在肝癌细胞系中构建低表达及过表达LRH-1的细胞模型,通过检测半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))、细胞增殖和平板克隆形成实验等功能学实验探索LRH-1在肝癌细胞中对奥沙利铂敏感性的影响;通过定量PCR检测LRH-1对多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)基因的转录调控作用;通过荧光素酶报告实验评估LRH-1对MDR1的转录激活能力。结果在HuH7细胞中过表达LRH-1后,细胞在奥沙利铂处理下,IC_(50)显著升高,达到18.012μmol/L,显著高于HuH-7对照组的2.042μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05);同时其细胞增殖能力显著增强,MDR1 mRNA表达水平明显升高。在HepG2细胞中敲低LRH-1表达后,细胞在奥沙利铂处理下,IC_(50)显著降低,为1.012μmol/L,显著低于HepG2对照组的6.294μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05);同时其细胞增殖能力和平板克隆形成能力显著降低,MDR1 mRNA表达水平明显降低。荧光素酶报告实验证实,LRH-1可以剂量依赖性激活MDR1启动子的转录活性,其特异性小分子抑制物ML-180能显著降低LRH-1对MDR1启动子的转录激活能力。结论LRH-1通过转录激活MDR1降低肝癌细胞对奥沙利铂的敏感性,因其特异性小分子抑制剂已经合成成功,LRH-1可作为肝癌耐药治疗的潜在靶点。

栀子酸调节胆汁淤积大鼠SHP-LRH-1信号通路的实验研究

目的:研究栀子酸(geniposidic acid,GPA)对α-萘异硫氰酸酯(α-naphthyl isothiocyanate,ANIT)诱导胆汁淤积大鼠胆汁酸代谢小分子异源二聚体伴侣受体(small heterodimer partner,SHP)与肝受体同源物1(liver receptor homologue 1,LRH-1)信号通路的调节.方法:将50只SD大鼠随机分为5组,分别为空白组、ANIT组、ANIT+GPA 100 mg/kg组(AG100组)、ANIT+GPA 50 mg/kg组(AG50组)、ANIT+GPA 25 mg/kg组(AG25组),每组10只,连续给药10 d,空白组和ANIT组用生理盐水灌胃,ANIT+GPA各组给予GPA,给药的第8天,除空白组外,其余各组用ANIT(65 mg/kg)灌胃1次造模,继续给药至第10天,测血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)和总胆汁酸(total bile acids,TBA)的含量;分离并培养大鼠原代肝细胞(rat primary hepatocytes,RPH),将RPH分为空白组、40μmol/L ANIT组、40μmol/L ANIT+GPA 4.00,1.00,0.25 mmol/L组(A4G,A1G和A0.25G组),real-time RT-PCR检测RPH中SHP和胆汁酸合成关键酶胆固醇7α羟化酶(cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1,CYP7a1)mRNA转录水平,蛋白印迹法检测SHP和CYP7a1蛋白表达;沉默实验中,将RPH分为空白对照组、阴性转染组、siRNA-LRH-1组(ZR组)、siRNA-LRH-1+GPA 4.00,1.00,0.25 mmol/L组(ZR4G、ZR1G、ZR0.25G组),检测SHP,CYP7a1和LRH-1蛋白和基因的表达;过表达实验中,将RPH又分为空白对照组、阴性转染组(空白转染siRNA-阴性组)、LRH-1过表达组(LRH-1过表达质粒,OE组)、LRH-1过表达质粒+GPA 4.00,1.00,0.25 mmol/L组(OE4G,OE1G,OE0.25G组),检测SHP,CYP7a1和LRH-1蛋白和基因的表达.结果:在体实验中,与空白对照组比较,ANIT组的TC和TBA均显著升高(均P<0.01)、TG无差别;与ANIT组比较,AG100组和AG50组的TC和TBA均显著降低(均P<0.01).RPH实验中,与空白对照组比较,ANIT组中SHP的蛋白和基因水平均显著降低(均P<0.01),CYP7a1的蛋白和基因水平均显著升高(均P<0.01);与ANIT组比较,A4G和A1G组的SHP基因和蛋白水平均显著升高(均P<0.01),A0.25G组SHP基因和蛋白水平均升高(P<0.05),A4G和A1G组的CYP7a1基因和蛋白水平均显著降低(均P<0.01).LRH-1沉默实验中,与阴性转染组比较,ZR组中CYP7a1和LRH-1蛋白和基因均显著抑制(均P<0.01),SHP无变化;与ZR组比较,ZR4G,ZR1G和ZR0.25G组SHP基因和蛋白水平均显著升高(均P<0.01),LRH-1和CYP7a1无显著变化.LRH-1过表达实验中,与阴性转染组比较,OE组的CYP7a1和LRH-1蛋白和基因均显著抑制(均P<0.01),SHP无变化;与OE组比较,OE4G和OE1G组SHP基因和蛋白水平均显著升高(均P<0.01),OE0.25G组SHP基因显著升高(P<0.05),LRH-1和CYP7a1无显著变化.结论:RPH中LRH-1的过表达能上调CYP7a1的活性,GPA可以改善ANIT诱导的胆汁淤积大鼠的生物化学水平和肝脏病理,其机制可能与GPA激活大鼠RPH中SHP造成LRH-1的消耗来降低CYP7a1的表达有关.

过表达MiR-381调控LRH-1-MMP-2通路抑制卵巢癌细胞转移的机制

目的探讨人卵巢癌组织中miR-381的表达及对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响。方法聚合酶链反应(PCR)检测卵巢癌组织中miR-381表达水平;慢病毒转染卵巢癌SKVO3细胞构建miR-381稳定过表达细胞株;通过划痕愈合试验、Transwell侵袭小室检测细胞迁移及侵袭情况,通过裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞建立肿瘤肺转移模型,检测过表达miR-381对肿瘤细胞体内转移的影响;PCR及Western印迹法检测miR-381潜在靶点肝受体同源物(LRH)-1的表达变化。结果 miR-381在卵巢癌组织中表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05);上调miR-381的表达能够抑制卵巢癌SKVO3细胞体外迁移(P<0.05)及侵袭能力(P<0.05);在体内,上调miR-381的表达对SKVO3细胞裸鼠肺转移瘤的形成具有抑制效应(P<0.05);机制上,过表达miR-381后显著抑制LRH-1在SKVO3细胞内的表达水平(P<0.05),并抑制了基质金属蛋白酶(MMP)-2表达水平(P<0.05)。结论 miR-381在卵巢细胞癌中表达降低,上调miR-381能够通过抑制LRH-1的表达进而抑制MMP-2表达而发挥抗肿瘤转移作用。