肝型丙酮酸激酶启动子与人胰岛素基因逆转录病毒介导感染pT67、HepG2细胞的蛋白质表达

目的检测新构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hInsg)逆转录病毒表达载体(pM54,LPKp-hInsg)在pT67、HepG2细胞的表达情况,为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病寻找新的优化生物载体。方法 (1)限制酶切父、母本质粒p54、pMDN-SIN,取相关片段构建含人Ins基因-逆转录病毒载体pM54(pMDN-SINq-p54;LPKp-hInsg);pM54扩增、纯化、酶切鉴定;(2)脂质体FuGENE 6转染pM54质粒进入pT67、Phoenix E和3T3细胞系,同时转染pCMVβGal和父本质粒p54做对照;(3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;(4)用转染后细胞培养上清液旋转感染pT67、HepG2细胞;(5)ELISA法检测转染、感染后细胞培养上清液Ins含量。结果酶切鉴定质粒与构建预期相符;ELISA法检测出转染、感染上清液中均含较高水平Ins。对照结果均为阴性。结论 LPKp-hInsg基因逆转录病毒表达载体pM54构建成功。人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染pT67等细胞,目的蛋白Ins获得了预期的表达。实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究奠定了基础。

M2型丙酮酸激酶在肝内胆管细胞癌组织中的表达及临床意义

【目的】探讨M2型丙酮酸激酶(PKM2)在肝内胆管细胞癌(ICC)组织中表达以及临床意义。【方法】对中山大学附属第一医院2008年1月至2010年9月期间行手术治疗的86例ICC患者的癌组织及癌旁组织运用免疫组化方法检测PKM2的表达水平,统计学分析PKM2的表达与ICC患者临床病理特征之间的关系,并作生存分析及预后因素评估。【结果】ICC组织中PKM2的表达明显高于癌旁组织(P<0.001)。癌组织中淋巴结转移患者中PKM2的表达明显高于非淋巴结转移患者(P<0.001);无远处转移患者中PKM2的表达明显低于远处转移者(P=0.002);发生低分化肿瘤的PKM2的表达明显高于中、高分化肿瘤(P=0.048);临床分期Ⅳ期的患者中PKM2表达明显高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者(P=0.006);肿瘤有神经束侵犯的患者PKM2表达明显高于无神经束侵犯患者(P=0.024)。生存分析提示ICC患者中PKM2高表达组的5年生存率(0%)明显低于PKM2低表达组(15%),差异具有统计学意义(P<0.001)。单因素和多因素分析均表明PKM2的表达(P<0.001)和神经束侵犯(P=0.012)为ICC患者的不良预后因素。【结论】PKM2与ICC的恶性特征密切相关,PKM2为ICC患者不良预后的独立因素。

M2型丙酮酸激酶同工酶表达对肝细胞癌化疗敏感性的影响

目的研究M2型丙酮酸激酶同工酶(PKM2)对肝癌细胞HepG2增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,探讨PKM2表达对肝细胞癌(HCC)化疗敏感性的影响。方法采用蛋白印迹和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测正常肝细胞株HL-7702和肝癌细胞株HepG2中PKM2蛋白和mRNA表达。构建靶向PKM2基因重组质粒(PKM2-siRNA)和对照质粒(siRNA-NC),并转染至HepG2细胞中,蛋白印迹和qRT-PCR检测PKM2敲低情况。细胞克隆形成、Transwell趋化和TUNEL法分析PKM2表达对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。不同浓度多柔比星(DOX)处理各组细胞后,CCK-8和TUNEL法检测细胞活性和凋亡。结果HepG2细胞株中PKM2蛋白和mRNA表达与HL-7702相比显著上调[mRNA(1.01±0.01)%对(5.04±0.02)%,蛋白(1.34±0.04)%对(4.03±0.02)%,P<0.05]。PKM2在PKM2-siRNA转染HepG2细胞中表达在转录和翻译水平显著降低,细胞克隆形成率、细胞侵袭数均低于空白转染组和转染siRNA-NC对照组,细胞凋亡率高于空白转染组和转染siRNA-NC对照组,DOX半抑制浓度(IC50)为7.25μg/mL,转染siRNA-NC对照组为18.51μg/mL。随着DOX给药浓度增加,细胞凋亡率显著增加。转染PKM2-siRNA细胞组凋亡数明显高于转染siRNA-NC对照组(P<0.05)。结论PKM2在人肝癌细胞株HepG2中高表达。敲低PKM2表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,增强对DOX化疗敏感性。PKM2可能是HCC治疗的潜在靶点。

M2型丙酮酸激酶在肝细胞癌中的研究进展

原发性肝细胞癌是世界上常见、恶性程度很高的肿瘤之一,在中国恶性肿瘤中发病率排第5位,肝癌的各种治疗措施疗效不佳。M2型丙酮酸激酶作为糖酵解途径关键酶,它的异常表达与肝癌的增殖、转移、诊断、治疗及预后密切相关,与肝癌药物治疗的耐药和放射线抗拒也有关联,采用多种途径靶向调控肝癌细胞的M2型丙酮酸激酶,有望成为治疗原发性肝癌的一个新方向。

PKM2对肝内胆管癌细胞增殖及上皮间质化的影响

目的检测M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)在肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)组织中的表达情况,探讨PKM2对ICC细胞增殖及上皮间质化(EMT)的影响。方法RT-PCR和免疫组化法检测ICC组织中PKM2的表达,慢病毒载体介导的RNA干扰PKM2的表达,观察其对ICC细胞增殖、侵袭能力及EMT相关生物学特性的影响。结果RT-PCR结果显示,PKM2在ICC组织中高表达(P<0.05)。体外实验显示,PKM2基因沉默在体外抑制了ICC细胞的增殖和侵袭能力,PKM2-RNAi转染组细胞克隆形成数(152±9.63)显著低于空白组(351.5±17.6)及对照组(333.1±21.3)(P<0.05)。转染组的侵袭能力明显低于空载(Mock)及对照组(Control)组,发生迁移的细胞数分别为(96.0±7.1)、(185.5±11.3)、(197.1±17.2)(P<0.05)。其具体机制是通过抑制Wnt/β-catenin信号传导,进而抑制EMT相关通路。结论胆管癌组织中PKM2表达明显高于癌旁组织,PKM2可通过Wnt/β-catenin信号调节EMT,进而调控ICC细胞侵袭的能力。

TUM2-PK在肝癌中的表达及临床意义

目的:研究肿瘤M2型丙酮酸激酶(TUM2-PK)在肝癌中的表达及其与肿瘤临床病理特征的关系。方法:RT-PCR法检测42例肝细胞肝癌组织及相应癌旁组织中TUM2-PK mRNA的表达并研究其与临床病理特征间的联系。结果:TUM2-PK mRNA在肝癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为83.33%(35/42)和57.14%(24/42),表达量为0.7230±0.6744和0.2594±0.2835,肝癌组织中TUM2-PK mRNA的阳性表达率及表达量显著高于癌旁组织(P<0.05)。TUM2-PK mRNA的表达与肝癌分化程度有关(P<0.05),而与肝癌的大小、门脉癌栓、淋巴转移、肝内转移、AFP水平及患者5年生存率无关(P>0.05)。结论:TUM2-PK mRNA的高表达提示肝癌的分化差。可作为评估肝癌恶性程度的生物学指标。

青少年发病的成年型糖尿病的基因与临床研究进展

青少年发病的成年型 糖尿病(MODY)是一组高度异质性的单基因遗传病,其临床特征为发病年龄小于25岁,有3代以上家族遗传史,符合常染色体显性遗传规律。迄今已发现至少5种MODY亚型,它们分别是MODY1 肝细胞核因子4αMODY2 葡萄糖激酶,MODY3-肝细胞核因子1α,MODY4 胰岛素启动子CDY肝细胞核因子1β。本文就MJODY有关的这些基因的结构及功能特点。从基因与临床表现的角度,综述目前国外关于MODY的研究进展。

大黄对二乙基亚硝胺致大鼠肝癌癌前损伤作用及机制

目的 探讨大黄(Rhubarb)对二乙基亚硝胺致大鼠肝癌癌前损伤的作用及机制。方法 将SD大鼠分为正常对照组、大黄处理组、DEN处理组和大黄+DEN处理组4组。采用酶活性检测谷丙转氨酶(SGPT)活性、HE染色观察各组肝组织病理变化、Western blot法检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,Erk1/2)、细胞外调节蛋白激酶磷酸化(p-Erk1/2)、缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、丙酮酸激酶同工酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM2)等蛋白的表达。结果 与正常对照组、大黄处理组、DEN处理组相比,大黄+DEN组血清SGPT活性显著升高。病理切片HE染色显示,正常对照组大鼠和大黄处理组大鼠的肝细胞形态正常。DEN处理组的大鼠中,肝细胞排列紊乱并呈玻璃体样病变。与DEN处理大鼠相比,大黄+DEN处理的大鼠肝组织病理学变化更严重。Western blot结果表明与其他组相比,大黄+DEN组大鼠肝组织中Erk1/2、p-Erk1/2、HIF-1α、PKM2等蛋白水平显著升高。使用白藜芦醇作为PKM2的抑制剂,Westrn blot结果显示,与大黄+DEN处理2组相比,白藜芦醇+大黄+DEN处理组大鼠肝组织中PKM2蛋白水平显著降低;HE染色结果表明白藜芦醇减弱了大黄联合DEN对肝损伤的促进作用。结论 单独使用大黄对肝脏无损害,但大黄与DEN联合使用可促进大鼠的肝损伤,这与PKM2介导的有氧糖酵解有关。

人肝细胞癌中OY-TES-1和PKM2的表达及调控关系初探

目的:探讨癌-睾丸抗原OY-TES-1和丙酮酸激酶M2型(PKM2)在人肝细胞癌(HCC)中的表达,并分析OY-TES-1对PKM2表达的影响。方法:利用LinkedOmics数据库筛选OY-TES-1表达正相关基因集;使用DAVID数据库对OY-TES-1进行功能富集分析,了解HCC中OY-TES-1潜在的生物学功能,寻找功能相关基因;通过GEPIA数据库分析和实时荧光定量PCR(qPCR)实验检测,探讨OY-TES-1和功能相关基因在HCC中的表达及临床意义;干扰HCC细胞株中OY-TES-1的表达,qPCR和Western blotting检测OY-TES-1功能相关基因的表达变化。结果:LinkedOmics数据库筛选获得1001个与OY-TES-1表达正相关的基因集;功能富集结果显示,OY-TES-1可能通过PKM2参与HCC细胞多糖合成、脂代谢、碳水化合物代谢等信号通路。GEPIA数据库分析显示,HCC组织中OY-TES-1和PKM2的表达显著高于正常肝组织,两者表达呈正相关关系(r=0.3;P<0.001);qRT-PCR证实OY-TES-1(癌组织:0.58±0.95 vs.癌旁组织:0.36±0.61,P<0.05)和PKM2(癌组织:0.14±0.17 vs.癌旁组织:0.08±0.14,P<0.05)在HCC组织中均为高表达,两者的表达呈正相关关系(r=0.482,P<0.001);尚未发现OY-TES-1和PKM2的表达与HCC患者临床参数相关。在HepG2和BEL-7404细胞株中干扰OY-TES-1表达,PKM2的mRNA和蛋白表达随之明显下调。结论:OY-TES-1和PKM2均高表达于HCC,且两者具有较强的表达相关性;HCC中OY-TES-1能够影响PKM2的表达。

肝癌组织中PKM2表达及与放疗敏感性的关系

目的检测肝癌组织中M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase,PKM2)的表达,并分析其与放疗敏感性的关系。方法回顾性分析80例肝癌患者的临床资料,患者均实施肝脏穿刺活检,且均符合三维适形放疗指征。检测肝癌组织中PKM2蛋白的表达,对比不同PKM2蛋白表达患者放疗前后血清AFP水平,对比不同PKM2蛋白表达患者的放疗效果和敏感性。探讨肝癌组织中PKM2表达与放疗敏感性的关系。结果肝癌组织中PKM2蛋白阳性率为87.50%;放疗前后肝癌组织中PKM2蛋白阳性者血清AFP水平均高于阴性者(P<0.05),且放疗后肝癌组织中PKM2蛋白阳性和阴性者血清AFP水平均低于放疗前(P<0.05);PKM2蛋白阳性者缓解率(放疗敏感率)低于阴性者(P<0.05);临床分期Ⅲ期、Ⅳ期,低分化,PKM2蛋白阳性均是放疗不敏感的独立危险因素(OR=3.274、5.328、5.942、7.135,P<0.05)。结论肝癌组织中PKM2阳性率高,且与血清AFP水平、放疗敏感性均密切相关,PKM2蛋白阳性等均是放疗不敏感的独立危险因素。

紫草素通过抑制PKM2/PHD3/HIF-1α通路诱导肝癌细胞凋亡

目的探讨紫草素诱导人肝癌细胞SMMC-7721死亡的可能机制。方法体外培养人肝癌细胞(SMMC-7721)和正常肝细胞(L-02),实验分为对照组和紫草素给药组(4、8、16μmol/L)。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,MTT法检测细胞活力,试剂盒检测三磷酸腺苷(ATP)和乳酸水平,免疫共沉淀和免疫荧光双染实验明确M2型丙酮酸激酶(PKM2)、脯氨酰酸羟化酶3(PHD3)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)三者之间的作用关系及蛋白表达情况;Annexin V/PI检测细胞凋亡;Western blot观察PKM2、PHD3、HIF-1α及凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2表达水平;采用小干扰核糖核酸(siRNA)干扰法建立PKM2低表达的人肝癌SMMC-7721细胞,Western blot检测PKM2低表达对人肝癌SMMC-7721细胞中的PHD3、HIF-1α蛋白表达水平的影响。结果紫草素对SMMC-7721和L-02细胞的半抑制浓度(IC50)分别是8.041μmol/L与31.75μmol/L,与对照组相比紫草素能抑制肝癌SMMC-7721细胞中PKM2、HIF-1α和PHD3蛋白表达及PKM2、HIF-1α入核(P<0.05)。免疫共沉淀和免疫荧光双染实验证实,紫草素可以抑制PKM2/PHD3/HIF-1α复合体形成(P<0.05),并且抑制有氧糖酵解产物乳酸和ATP含量(P<0.05)。与对照组相比,PKM2敲低后PHD3和HIF-1α表达明显降低(P<0.05);与未处理组相比,紫草素处理后凋亡率明显升高且凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表达升高,Bcl-2表达下降(P<0.05)。结论紫草素靶向PKM2调控PHD3/HIF-1α复合物,从而抑制肝癌细胞的有氧糖酵解,破坏其供能途径,导致肝癌细胞凋亡。

ATF4过表达对HepG2细胞凋亡的影响及其机制

目的观察转录激活因子4(ATF4)过表达对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法构建ATF4表达质粒,采用脂质体瞬时转染HepG2细胞。实验分为空白对照组、空质粒组和ATF4质粒组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率,检测HepG2细胞培养液中乳酸含量,Western blot检测Warburg效应蛋白M2型丙酮酸激酶(PKM2)的表达。结果与空质粒组比较,ATF4质粒组HepG2细胞凋亡率显著增加,细胞培养液中乳酸含量显著降低,HepG2细胞中PKM2蛋白的表达显著下调(均P<0.05)。结论过表达ATF4促进HepG2细胞的凋亡,其机制可能与抑制Warburg效应有关。

PKM2在肝细胞肝癌中的表达及其与预后的关系

目的探讨M2型丙酮酸激酶(PKM2)在肝细胞癌(以下简称"肝癌")组织中的表达,并分析其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。方法收集2008年1月至2011年1月期间重庆市第九人民医院和重庆市九龙坡第二人民医院病理诊断为肝癌的石蜡标本,采用免疫组织化学方法检测肝癌组织中PKM2蛋白的表达,采用Kaplan-Meier生存分析法、Cox回归法分析PKM2蛋白表达与肝癌患者临床预后的关系。结果共收集196例肝癌患者的石蜡组织标本,其中129例(65.8%)肝癌患者的肝癌组织中PKM2蛋白高表达,其高表达与肝癌患者的性别(P=0.049鴐、肿瘤分化程度(P=0.000鴐、血清甲胎蛋白水平(P=0.010鴐、肿瘤数目(P=0.002)及TNM分期(P=0.001)有关,而与患者的年龄、有无肝硬化、肿瘤最大直径及乙肝表面抗原无关(P>0.05鴐。PKM2蛋白高表达患者的1、3、5年总体生存率和无瘤生存率均明显低于PKM2低表达患者(P<0.05鴐,且多因素Cox回归分析结果显示PKM2蛋白高表达是肝癌患者总体生存率(HR=1.661,P=0.024)及无瘤生存率(HR=1.662,P=0.013)的独立危险因素。结论 PKM2可能对肝癌患者的生物学行为有重要影响,可作为判断肝癌预后的一个新指标。