异种肝移植的挑战与机遇

器官移植是治疗终末期器官衰竭最有效的方式,但供器官的严重匮乏导致许多患者在等待移植的过程中死亡。随着基础研究的突破、基因编辑技术的发展和新型免疫抑制剂的问世,异种移植被视为解决供器官短缺问题最具潜力的方式。近些年,国内外研究人员在非人灵长类动物(NHPs)、脑死亡患者,终末期心力衰竭、终末期肾病和晚期肝癌患者上陆续开展了多项研究,但免疫排斥反应和凝血功能障碍等诸多问题仍限制着受者的生存,也阻碍着异种移植在临床应用方面取得实质性突破。因此,本文系统地回顾了当前国内外异种移植研究的最新进展,聚焦异种肝移植后免疫排斥反应和凝血功能障碍等问题的解决策略。

辅助性异种肝移植的应用现状

辅助性肝移植(auxiliary liver transplantation,ALT),即在保留受体全部或部分肝脏的同时,利用部分或完整异体肝脏,植入受体体内,以实现暂时性或永久性,替代或增强受体固有肝脏功能的技术。随着ALT技术的进步,目前技术手段包括原位ALT、异位ALT。

氮自由基(NO)在鼠肝异种移植超急性排斥反应中的作用

目的 应用大鼠肝脏灌注模型研究氮自由基在异种移植超急性排斥反应中的作用。方法 SD大鼠 18只分为 3组 ,每组 6只 ,分为鼠血灌注鼠肝组、人血灌注组、N 乙酰半胱氨酸 (NAC)治疗人血灌注鼠肝组。全麻下分离出门静脉、肝上下腔静脉并插管 ,缺血 30min后 ,原位灌注鼠肝 2h ,在不同时间取血检测氮自由基 (NO)、肝功能 (ALT)。结果 在异种灌注组 ,NO、ALT的升高均明显高于对照组 ,NAC的治疗抑制了异种灌注组的NO、ALT的升高 ,保护了肝脏功能。结论 氮自由基可能参与了异种移植的超急性排斥反应 ,NAC可部分抑制这种反应并保护异种移植的大鼠肝脏功能。

细胞毒T淋巴细胞在异种肝移植急性排斥反应中的作用

目的 探讨异种肝移植中细胞毒T淋巴细胞 (CTL)参与急性排斥反应的机制。 方法 三袖套法建立仓鼠到大鼠原位肝移植模型 ;免疫组化方法检测同基因组与异种移植组 (XT组 )移植肝术后CD8和CD4型淋巴细胞浸润及Fas L ,穿孔素的表达情况 ,并运用原位末端标记法检测移植肝细胞的凋亡情况。 结果 XT组移植肝术后第 2d汇管区出现淋巴细胞浸润 ,逐日增多 ,至术后 5～ 6d达高峰 ;术后第4d穿孔素及Fas L开始表达 ,术后第 5～ 6d达高峰 ;穿孔素的表达始终高于Fas L。 结论 异种肝移植中T淋巴细胞参与了其免疫排斥反应 ,通过表达穿孔素或Fas L使靶细胞坏死或凋亡。

微囊化异种肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭

目的:探讨微囊化猪肝细胞异种移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的可行性.方法:将分离的猪肝细胞微囊化后移植到Wistar大鼠腹腔内,3d后切除大鼠80%肝叶造成肝衰模型,观察大鼠2wk存活情况.结果:对照组、未微囊化肝细胞移植组及微囊化肝细胞移植组的2wk存活率分别为6.2%,31.2%和56.2%,微囊化组肝细胞存活率明显较未微囊化组及对照组高.微囊化肝细胞在移植14d后结构基本完好.结论:微囊化异种肝细胞移植提供了一种治疗急性肝功能衰竭的可行方法.

猪肝细胞异种移植过程中移植肝细胞凋亡

目的探讨猪肝细胞异种移植后移植肝细胞凋亡情况。方法采用原位胶原酶循环灌注法分离中国实验用小型猪肝细胞。D氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠急性肝衰竭模型，48h时将培养24h的猪肝细胞悬液2ml（含5．0×10^7个肝细胞）移植到急性肝衰竭大鼠腹腔内，观察移植后ALF大鼠2周存活率和肝功能变化；收集移植后不同时段的移植肝细胞观察其病理变化，应用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪检测移植肝细胞的凋亡率、坏死率及存活率。结果2周存活率√UF大鼠为18．75％，移植组为56．25％（P〈0．05）。注药后48h肝功能明显恶化，移植后肝功能明显改善。移植肝细胞在腹腔内存活时间约3～5d。肝细胞体外培养24h已有凋亡出现。与培养24h时相比，移植后24h，移植肝细胞凋亡率明显上升，活率明显下降（P〈0．05），坏死率无明显上升（P〉0．05）；与移植后24h相比，移植后48h，移植肝细胞凋亡率进一步上升，活率进一步下降（P均〈0．05），坏死率仍没有明显变化（P〉0．05）；移植后72h，移植肝细胞摄亡率明显下降，与体外培养24h相比，差异无显著性（P〉0.05），与移植48h相比，移植肝细胞活率无明显变化（P〉0．05），移植肝细胞坏死率明显上升（P〈0.05）。结论猪肝细胞异种腹腔内移植时，移植肝细胞仅能存活3～5d，早期免疫排斥以肝细胞凋亡为主，3d后则以肝细胞坏死为主。

药物性肝衰大鼠脾内移植异种肝细胞治疗前后的CD4,CD8的变化及意义

为探讨异种肝细胞脾内移植治疗大鼠药物性肝衰的意义 ,观察大鼠肝功能、存活率及CD 4,CD8在免疫排斥反应中的作用。笔者以豚鼠肝细胞为供体 ,SD大鼠为受体 ,D -氨基半乳糖(19.5ml/ )腹腔内一次性注射 ,制作肝衰模型。 48h后将微囊化的游离豚鼠肝细胞移植于大鼠脾脏内。以豚鼠裸肝细胞移植及生理盐水脾脏注射为对照。移植后 14d测定存活率和肝功能 ,检查病理切片及CD 4,CD 8的变化。结果示微囊化肝细胞移植组存活率 80 .0 % ,明显高于生理盐水组(2 5 .0 % )和裸肝细胞移植组 (70 .0 % ) (分别为P <0 .0 1和P <0 .0 5 )。微囊肝细胞移植组 14d总胆红素和ALT ,明显低于生理盐水组和裸肝细胞组。移植后 72h和 14d分别测定受体脾脏CD4,CD8淋巴细胞 ,移植后 72h ,14d微囊化肝细胞组、裸肝细胞组CD 4,CD 8均呈阳性。提示 :大鼠药物性肝衰微囊化肝细胞脾内移植后可维持受体存活 14d ,体液和细胞免疫均参与排斥反应。肝细胞微囊化处理可延迟细胞免疫的发生时间。

猪作为供体的异种肝移植的研究与进展

背景:猪易于饲养,易繁殖,器官大小与人较匹配,并且可通过基因调控技术来增强供受体器官匹配性,因此猪是最佳异种供体器官的大动物模型。目的:总结近年来猪作为供体的异种移植研究进展。方法:应用计算机检索PubMed数据库及万方数据库2001-01/2010-12有关以猪及非人类灵长类为供体进行异种移植的文献报道。结果与结论:使用猪作为供体的异种移植应用于临床可能会缓解供体器官短缺的问题,然而异种移植免疫学方面还存在某些障碍,可通过基因工程技术和开发新型免疫抑制剂来解决。至此所进行的研究还不能完全克服免疫排斥反应,并且除免疫因素外,还有异种病原的感染问题,如猪内源性反转录病毒。现在还不能确定是否具有潜在的感染性,随着进一步的研究,将会彻底克服免疫排斥和病毒感染等问题。

Fah^(-/-)Rag2^(-/-)IL2Rg^(-/-)小鼠肝脏原位异种重建模型的建立及其评价

目的:构建猪-小鼠肝细胞嵌合模型,探讨猪肝细胞在无T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)介导排斥条件下的移植及再生的相关条件,评估猪肝细胞在异种受体中的定居、增殖和功能因子分泌情况,为提高猪源化小鼠模型中猪肝细胞的重建效率提供依据。方法:采用脾脏内注射法将猪肝细胞移植至Fah^(-/-)Rag2^(-/-)IL2Rg^(-/-)(FRG)小鼠体内,构建移植模型。将16只FRG小鼠随机分为对照组、空白对照组、实验组和绿色荧光蛋白(GFP)基因实验组,每组4只。空白对照组小鼠停止给予2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,4-环己二酮(NTBC),监测体质量;对照组4只小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d;实验组小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d;GFP基因实验组小鼠注射携带GFP基因猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d。观察各组小鼠体质量、生存情况。检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,流式细胞术检测各组小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞表达情况,ELISA法检测各组小鼠血清中猪白蛋白表达水平,免疫组织化学法检测各组小鼠猪肝细胞再生效率。结果:与剪碎后再以胶原酶消化的方式比较,两步灌注法消化过程更温和、对细胞损伤更小,细胞活性可以达到92%。停止给予NTBC后,对照组小鼠体质量进行性降低,生命活力逐渐降低。连续停药第28天小鼠开始出现死亡现象。小鼠肝组织中出现肝细胞肿大、细胞浆疏松透亮和细胞核溶解等不可逆细胞损伤。空白对照组小鼠停药后血清中ALT水平逐渐升高。对照组停药小鼠重新给予NTBC后,体质量逐渐恢复至正常水平。流式细胞术,停止给予NTBC后,小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞完全缺失。免疫组织化学染色,实验组小鼠肝组织中未见深色Fah+阳性细胞,移植小鼠肝组织中可见深色Fah+阳性细胞,猪肝细胞再生效率为(11±4)%。GFP基因实验组小鼠可见同一视野经三色激光分别激发,猪肝细胞再生效率为(10±2)%。结论:成功构建了猪源化FRG小鼠肝脏嵌合模型,建立了长效稳定扩增猪肝细胞的小鼠模型。

异种肝细胞移植研究现状

uPA/RAG-2小鼠的发现为异种肝细胞移植研究提供了—个有效的动物模型.在uPA/RAG-2转基因小鼠脾内注入大鼠、土拨鼠、人肝细胞后,均能部分或完全取代小鼠肝细胞. 文章主要介绍了大鼠、土拨鼠、人肝细胞在uPA/RAG-2转基因小鼠内的增生、对肝功能影响等情况,同时探讨了该模型体系存在问题及应用前景.

非协调性异种肝移植后再灌注障碍及超微结构变化的观察

目的 :探讨非协调性异种肝移植供肝再灌注障碍与超急性排斥反应的可能关系。方法 :应用改良缝合法建立豚鼠至大鼠的肝移植动物模型 ,观察供肝再灌注 6 0分钟内门脉灌注和肝脏组织超微结构的变化。结果 :移植后 6 0分钟供肝门脉灌注明显减少 ;肝细胞的线粒体明显肿胀 ,线粒体嵴破坏、结构紊乱 ,内质网扩张、脱粒 ,肝细胞狄氏间隙消失 ,肝血窦内可见到血小板和粒细胞粘附、聚集和血栓形成 ,部分内皮细胞消失。受体心肌细胞肿胀 ,肌原纤维排列紊乱、疏松化和断裂 ,线粒体呈多形性 ,大小不等。结论 :豚鼠至大鼠非协调性异种肝移植 6 0分钟时有超急性排斥反应的发生 ,从而导致供肝的灌注障碍 ,同时心肌的受损可以进一步加重供肝的微循环障碍。

异种肝移植模型-转人CD59蛋白基因小鼠的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD5 9蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD5 9cDNA的启动子 ,CMV作为报告基因GFP的启动子 ,构建重组质粒 pGOC。通过显微注射法 ,把CMV GFP OMT CD5 9基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果 产生出 86只F0 代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测 ,12只阳性 ,进一步用Southernblot法检测 1只阳性。结论 通过显微注射法 ,外源基因hCD5 9cDNA在小鼠基因组中得到整合 ,产生出了阳性转人CD5 9蛋白基因小鼠 。

异种肝细胞脾内移植海藻酸钠包裹最佳浓度及免疫隔离机制的初步研究

目的:探讨微囊化异种肝细胞脾内移植对药物性肝衰大鼠的治疗过程中海藻酸钠包裹移植肝细胞的最佳浓度;观察受体存活率,测定肝功能及CD4,CD8的变化。方法:分别以浓度为5.0%、1.5%、0.15%的海藻酸钠悬液体外包裹经胶原酶技术制备的异种(豚鼠)肝细胞为供体,SD大鼠为受体,D-氨基半乳糖(19.5ml/kg)腹腔内一次性注射,制作肝衰模型。48h后将三组微囊化的游离豚鼠肝细胞(1.5×107个)分别移植入大鼠脾脏内。以生理盐水1.2ml脾脏注射为对照。移植后48h、96h观察存活率,肝功能、免疫球蛋白及肝脏病理情况,免疫组化ABC法测定CD4,CD8的变化。结果:微囊化肝细胞移植组存活率分别为50.0%、80.0%、90.0%,明显高于生理盐水组(25.0%)(P<0.01)。移植后96h测定总胆红素和AST显示:在不同浓度的三组微囊化移植肝细胞中,0.15%的海藻酸钠包裹组明显低于其它各组及对照组。移植后48h、96h,分别测定受体脾脏CD4,CD8淋巴细胞,0.15%微囊包裹组96h呈阳性,1.5%、5.0%包裹组48h均呈阳性。结论:大鼠药物性肝衰微囊化肝细胞脾内移植海藻酸钠包裹浓度为0.15%,细胞免疫参与排斥反应,包裹浓度过高影响移植肝细胞功能及免疫隔离效果。

协同性异种肝移植急性排斥反应模型的探索

目的探索协同性异种肝移植急性排斥反应模型的建立。方法参照Kamada"二袖套法"并加以改良,分别对Wistar-Wistar大鼠(A组)15对及金黄地鼠-Wistar大鼠(B组)21对进行原位肝移植术,术后观察大鼠一般情况,并于第1、3、5、7天时各处死1只取肝脏组织进行病理观察,余留做观察生存时间。结果A、B两组供体手术时间、修肝时间、无肝期分别为(23±3)min、(8±2)min、(45±5)min、(17±2.5)及(46±3)min、(21±2.5)min、(18±2)min,手术成功率分别为81.0%与93.3%。A、B两组生存期分别为27.4±3.4天及5.5±1天。A组术后Williams分级均为0级,B组术后第1天1级,第3天2级,超过第5天均为3级。结论①利用改良Kamada"二袖套法"可建立稳定的金黄地鼠-Wistar异种肝移植模型;②同时建立了协同性急性排斥反应肝移植模型,并为解决供肝来源不足方面提供了研究基础。

异种肝移植的临床问答

1异种肝移植类型主要有哪些？ 异种肝移植主要包括3种类型： （1）原位肝移植主要用于永久性肝脏取代或移植前过渡性治疗。

异种肝移植的发展现状

目前由于肝移植的迅速发展，供肝不足的矛盾越来越突出，异种肝移植有望解决此矛盾，这就使医学工作者不得不深入进行异种肝移植的研究。

肝细胞生长因子治疗异种肝移植大鼠慢性肝功能障碍研究

目的研究肝细胞生长因子(HGF)防止异种肝移植大鼠肝功能障碍及作用机理。方法以DA大鼠(RT1a)为供体,Lewis大鼠(RT1l)为受体建立异种肝移植鼠模型,HGF组和对照组大鼠移植后他克莫司(每天0.1 mg/kg)肌内注射5天;HGF组大鼠在移植10天起静脉注射HGF(1 mg/kg,每周2次),持续至90天。对照组大鼠不予HGF处理。空白对照组不予任何处理。常规法检测血清TB含量、ALT活性,ELISA法检测TNF-α含量。结果 HGF组ALT、TB均较对照组低,且存活率明显高于对照组,肝脏病理活检显示肝脏无明显坏死,且HGF组TNF-α水平较对照组显著减低。结论 HGF对肝功能有保护作用,可能通过抑制TNF-α活性而发挥对肝脏的保护作用。

豚鼠至大鼠异种肝移植手术操作要点及体会

目的建立稳定的豚鼠至大鼠的异种肝移植模型。方法在传统"二袖套"法基础上进行改良,并分预实验和正式试验两组进行手术时间和手术成功率的比较。结果实验通过改良型二袖套法进行肝移植手术80对,预实验手术25对,成功率68%,正式手术35对,成功率89%,显著高于预实验(P<0.05),而手术时间明显低于预实验(P<0.05)。结论改进的异种肝移植术操作简便,随着手术者经验的提高可明显提高手术成功率,可作为异种肝移植实验可靠的动物模型制作。

异种肝移植研究进展

自美国医生Starzl在1967年7月23日成功完成人类首例同种异体肝移植以来,历经半个多世纪的发展,临床肝移植技术逐渐成熟。同种肝移植是目前治疗肝硬化、肝恶性肿瘤等终末期肝病,及伴有危及生命的急性肝坏死或一些代谢性疾病的一种挽救生命的治疗方法。临床肝移植供肝最主要来源是公民死亡后的器官捐献,但是由于死亡后有效捐献器官的稀缺性和器官获得及时性问题,远远不能满足临床肝移植需要。活体肝部分捐献是公民死亡后器官捐献不足的有益补充,但由于活体捐肝手术的潜在风险,违背了医学伦理关于临床诊疗无伤害原则,而限制了活体肝移植的发展。

细胞和体液免疫抑制对大鼠异种肝移植急性排斥中一氧化氮及其合酶、同功酶的影响

目的 :探讨一氧化氮、一氧化氮合酶 (NOS)及其同功酶在大鼠异种肝移植中的免疫学作用及其表达意义。方法 :本实验共分 5组 :Ⅰ组 (同基因组 ) ;Ⅱ组 (急性排斥组 ) ;Ⅲ组 (细胞免疫抑制组 ) ;Ⅳ组 (体液免疫抑制组 ) ;Ⅴ组 (双重免疫抑制组 ) ;应用血清学检测移植术后受体血清ALT、TNF α及NO代谢终产物 (NOx) ,应用NADPH黄递酶组化及免疫组化检测NO合酶及其同功酶 (iNOS ,cNOS)的表达。结果 :Ⅱ、Ⅳ组血清ALT ,TNF α及NOx均较Ⅰ、Ⅴ组明显升高 4～ 11倍 (P <0 .0 1) ,环孢素A(Ⅲ组 )能抑制细胞免疫及NO的合成与表达 ,但不能延长受体的生存期。Ⅱ、Ⅳ组NO合酶及其同功酶 (iNOS ,cNOS)在异种肝移植急性排斥时明显表达。结论 :肝细胞NO在低免疫反应状态下可能具有肝细胞保护作用 ,而在高免疫反应状态下iNOS的持续高表达可能是肝损伤的原因。