沉默CTGF对肝星状细胞凋亡及胞外基质表达的影响

目的 观测沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSC_T6)的生长与凋亡,以及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、CTGF、整合素α5(integrin alpha 5,Itgα5)和Ⅰ型胶原(collagenⅠ, ColⅠ)表达的影响。方法 将CTGF-shRNA病毒感染HSC_T6(实验组)。空病毒感染的HSC_T6(空病毒组)或未感染的HSC_T6(正常组)作对照。在显微镜下观测被感染HSC_T6的生长与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达变化;采用CCK-8(cell count kit-8)比色检测被感染HSC_T6的增殖情况;流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测被感染HSC_T6的凋亡情况。定量PCR、Western blot及免疫荧光细胞化学分别检测PCNA、CTGF、Itgα5和ColⅠ的表达变化。结果 在显微镜下观察到被感染的HSC_T6高表达GFP。CCK-8结果表明,与对照相比,沉默CTGF基因的HSC_T6生长显著受抑,72 h开始其差异具统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,沉默CTGF基因可诱导HSC_T6凋亡。定量PCR、Western blot及免疫荧光细胞化学结果证实,沉默CTGF基因可在mRNA及蛋白水平明显下调HSC_T6的PCNA、CTGF、Itgα5与ColⅠ的表达,与对照比较,差异均具统计学意义(P<0.05)。结论 沉默CTGF基因可下调HSC_T6的PCNA、CTGF、Itgα5及ColⅠ的表达,抑制HSC_T6的生长,诱导HSC_T6凋亡,其机制可能和HSC_T6的CTGF/Itgα5信号通路受阻紧密相关。

SHP2过表达抑制人肝星状细胞LX-2凋亡

目的探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)过表达对人肝星状细胞LX-2凋亡的影响。方法将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2转染LX-2细胞。实验分为3组:(1)Control组,以DMEM代替腺病毒转染LX-2细胞;(2)Ad-GFP组,转染空病毒Ad-GFP;(3)Ad-SHP2组,转染重组腺病毒Ad-SHP2。Western blotting检测3组LX-2细胞的SHP2、Bax、Bcl-2蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测3组LX-2细胞的SHP2 mRNA表达;TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测3组LX-2细胞凋亡情况。结果Ad-SHP2组LX-2细胞的SHP2蛋白及mRNA相对表达量高于Control组及Ad-GFP组(P<0.05);Ad-GFP组与Control组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测结果显示,与Control组LX-2细胞凋亡率(3.08±0.73)%、(9.44±0.80)%及Ad-GFP组(3.25±0.85)%、(8.89±1.98)%比较,Ad-SHP2组(1.52±0.26)%、(2.44±0.93)%降低(P<0.05);Ad-GFP组与Control组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组LX-2细胞的Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05);Ad-SHP2组LX-2细胞的Bax蛋白相对表达量(1.55±0.21)低于Control组(1.99±0.15)及Ad-GFP组(2.00±0.16)(P<0.05);而Bcl-2蛋白相对表达量(2.13±0.25)则高于Control组(1.71±0.15)及Ad-GFP组(1.52±0.14)(P<0.05);但Ad-GFP组与Control组Bax及Bcl-2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论SHP2过表达通过升高Bcl-2/Bax抑制体外人肝星状细胞LX-2凋亡。

骨髓间充质干细胞来源外泌体调节大鼠肝细胞凋亡的机制

背景:骨髓间充质干细胞可释放大量外泌体,关于骨髓间充质干细胞来源外泌体对肝细胞凋亡的影响以及具体机制还没有完全阐明。目的:探索骨髓间充质干细胞来源外泌体所携带的miR-21-5p对大鼠肝脏细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,将miR-21-5p NC或miR-21-5p inhibitor转染到骨髓间充质干细胞中,采用超速离心法提取外泌体,命名为(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos,将外泌体与BRL大鼠肝细胞共培养,观察抑制miR-21-5p表达后对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过双荧光素酶报告基因检测验证外泌体中miR-21-5p和PIK3R1之间的靶向关系;TUNEL检测外泌体中miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路对BRL大鼠肝细胞凋亡的影响。结果与结论:①双荧光素酶报告系统证实,PI3KR1野生型载体与miR-21-5p mimics共转染293T细胞时的荧光素酶活性显著低于PI3KR1突变型载体共转染组,表明miR-21-5p可靶向结合PIK3R1;②TUNEL检测结果显示:相比于(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组,(BMSCs+miR-21-5p inhibitor)-Exos处理后BRL肝细胞凋亡率显著增加;与(BMSCs+miR-21-5p NC)-Exos组相比,加入AKT抑制剂LY294002之后,细胞凋亡率显著增加;③结果提示:外泌体可能通过miR-21-5p直接靶向PIK3R1激活PI3K/AKT信号通路抑制BRL大鼠肝细胞凋亡。

黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞凋亡率剂量效应模型的构建

通过黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)诱导大鼠肝细胞凋亡的定量数据,从而构建AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率的剂量效应模型。通过拟合模型获取决定系数和进一步的数学检验表明,Gamma模型(R2=0.996 4,赤池信息量准则=37.40,贝叶斯信息准则=17.19)优于其他模型。建议选用Gamma模型作为大鼠急性暴露于AFB1后肝细胞凋亡率的最优剂量效应模型,用于AFB1风险评估框架中的危害特征描述。

失巢凋亡相关miRNAs预测肝细胞癌预后的分析

目的:利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库筛选肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中与失巢凋亡相关的miRNAs(anoikis-related miRNAs,armiRNAs),基于筛选出来的miRNAs构建HCC预后列线图模型,探讨armiRNAs与HCC预后的相关性,为HCC的治疗提供新的靶点。方法:从TCGA数据库下载RNA转录数据,筛选在HCC和癌旁组织中差异表达的armiRNAs,采用单因素Cox回归和LASSO回归分析鉴定具有预后意义的armiRNAs,通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价其可靠性,并构建预后列线图模型。利用该模型,使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)进行基因富集分析及药物敏感性研究。通过RT-qPCR对人正常肝细胞系LO2和三种人肝癌细胞系中差异表达的armiRNAs进行验证。结果:本研究经过筛选得到7个armiRNAs,根据风险评分将肝癌样本分为高、低风险组,Kaplan-Meier生存曲线显示两组之间存在显著差异,死亡人数随着风险评分的增加而增加。预测1年、2年、3年生存率的ROC曲线的AUC值分别为0.794、0.789、0.781,表明该模型具有较高的区分度。针对不同风险组对抗肿瘤药物敏感性的研究结果表明,高危组对多种抗肿瘤药物敏感性较高。实验验证显示,与LO2细胞相比,三种人肝癌细胞系中hsa-miR-4661、hsa-miR-1180表达水平显著增高,hsa-miR-139、hsa-miR-101-2、hsa-miR-326、hsa-miR-29c表达水平显著下降,而hsa-miR-509-3-5p在HepG2细胞中表达显著降低,在SMMC-7721、MHCC97细胞中表达显著升高。结论:本研究共筛选出7个armiRNAs,基于这些基因构建的模型能够较好的预测HCC患者的生存率及患者对药物的敏感性,这些结果可为探索肝癌预后标志物和临床个体化治疗提供重要参考。

Caspase-3介导的细胞凋亡与细胞焦亡在肝细胞癌的作用及其中药治疗的研究进展

细胞凋亡与细胞焦亡是两种重要的程序性细胞死亡方式,而半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在这两种死亡方式中都扮演着重要的角色,其参与了内源性、外源性途径介导的细胞凋亡以及Caspase-3/GSDME依赖性细胞焦亡,在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的治疗中起到了至关重要的作用。近年来,通过Caspase-3介导细胞凋亡及细胞焦亡治疗肝细胞癌的中药研究文献不断增加,在为肝细胞癌治疗提供思路方面具有巨大潜力。文章就Caspase-3介导的细胞凋亡与焦亡在肝细胞癌的作用及其在中药治疗方面的研究成果作一综述,以期为肝细胞癌的治疗和药物研究提供帮助。

α-常春藤皂苷通过激活和稳定p53/Noxa信号诱导肝癌细胞凋亡

目的研究预知子活性成分α-常春藤皂苷对肝癌细胞的体内外抑制作用及其机制。方法将肝癌细胞分为4组,分别给予0、10、20和30μmol·L^(-1)α-常春藤皂苷至24、48 h。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡率,转录组学筛选α-常春藤皂苷作用的信号通路,核糖核酸(RNA)干扰、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹检测信号通路和凋亡通路信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表达,体内移植瘤试验验证α-常春藤皂苷体内对肝癌细胞生长的抑制作用。结果α-常春藤皂苷通过激活腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)和Caspase3诱导肝癌细胞凋亡。转录组学、qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测发现α-常春藤皂苷上调了p53和Noxa的表达,并抑制p53和Noxa蛋白的降解,α-常春藤皂苷还能逆转p53/Noxa敲低所致的凋亡减少。动物实验结果表明,α-常春藤皂苷可抑制肝癌细胞移植瘤的增殖。结论α-常春藤皂苷可通过激活和稳定p53/Noxa信号诱导肝癌细胞凋亡。

坏死性凋亡相关的长链非编码RNAs生物标志物预测肝细胞癌预后模型的构建

目的构建基于坏死性凋亡相关的长链非编码RNAs(necroptosis-related long non-coding RNAs,NRLs)的肝细胞癌预后模型。方法从TCGA数据库下载肝细胞癌的转录本数据和临床信息。采用LASSO-Cox模型构建预后预测模型,受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)和校准曲线评估该模型的预测价值,并进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)和免疫浸润分析。qRT-PCR验证4个NRLs在肝细胞癌细胞Huh7和正常肝细胞MIHA中的差异表达。结果本研究构建了基于AL117336.2、MKLN1-AS、FOXD2-AS1、LINC01224等4个NRLs的肝细胞癌风险预后模型。基于训练集构建的风险评分是预后的独立影响因素(HR=1.275,P<0.001)。在训练集中,风险模型预测1、3、5年OS的AUC分别为0.816、0.747、0.752,在测试集中分别为0.713、0.621、0.626,且校准曲线显示模型有较好的一致性。根据中位风险评分将患者划分为高、低风险组,训练集和测试集中高风险组的总存活率均低于低风险组(均P<0.05)。此外,不同风险组中免疫细胞浸润程度和免疫检查点分子的表达差异有统计学意义(均P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,4个NRLs在肝细胞癌细胞Huh7中的表达水平均高于正常肝细胞MIHA(均P<0.05)。结论本研究成功构建了预测肝细胞癌患者预后的NRLs模型,对指导临床治疗具有潜在的价值。

lncRNA MAFG-AS1靶向miR-3180-3p调控口腔鳞癌HSC4细胞增殖和凋亡

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)MAFG反义RNA1(MAFG-AS1)靶向miR-3180-3p对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:实时定量PCR检测口腔鳞癌组织和对应正常黏膜中MAFG-AS1和miR-3180-3p表达。以口腔鳞癌细胞HSC4为研究对象,分别构建干扰MAFG-AS1、过表达miR-3180-3p或抑制miR-3180-3p表达的口腔鳞癌细胞株,CCK-8、平板克隆实验、流式细胞术、蛋白印迹法检测细胞活力、克隆形成数、凋亡率及cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9表达。荧光素酶报告实验验证MAFG-AS1和miR-3180-3p的靶向关系。结果:与正常黏膜比较,口腔鳞癌组织MAFG-AS1表达显著升高(P<0.05),miR-3180-3p表达显著降低(P<0.05)。干扰MAFG-AS1或过表达miR-3180-3p均可降低HSC4细胞活力和克隆形成数(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05),上调cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9蛋白表达(P<0.05)。miR-3180-3p是MAFG-AS1的直接靶点,MAFG-AS1负调控miR-3180-3p表达。抑制miR-3180-3p可增加HSC4细胞活力和克隆形成数(P<0.05),抑制细胞凋亡(P<0.05),下调cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9蛋白表达(P<0.05),进而削弱干扰MAFG-AS1对HSC4细胞的增殖抑制和凋亡促进作用(P<0.05)。结论:干扰MAFG-AS1通过上调miR-3180-3p表达抑制口腔鳞癌HSC4细胞增殖,促进细胞凋亡。

载脂蛋白C1表达对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的:探讨载脂蛋白C1 (APOC1)表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步阐明其相关分子机制。方法:通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析肝癌患者癌组织中APOC1 mRNA表达水平及其与患者预后的关系。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测不同肝癌细胞中APOC1mRNA表达水平,筛选APOC1低表达的人肝癌HepG2细胞作为研究对象。将pcDNA3.1-APOC1质粒转染至HepG2细胞过表达APOC1 (APOC1过表达组),以转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞为对照组,采用MTS法和5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测2组细胞增殖活性和增殖率,Transwell小室实验检测2组细胞中迁移细胞数,流式细胞术和TUNEL法检测2组不同细胞周期细胞百分率和细胞凋亡率,Western blotting法检测2组细胞中细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、蛋白激酶B (AKT)、磷酸化AKT (p-AKT)、B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)和活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (cleaved caspase-3)蛋白表达水平。结果:TCGA数据库分析,肝癌患者癌组织中APOC1 mRNA表达水平低于正常肝组织(P<0.05),并且APOC1 mRNA低表达组肝癌患者预后较差。RT-qPCR法检测,HepG2细胞中APOC1 mRNA表达水平最低,选取该细胞作为后续研究对象。与对照组比较,APOC1过表达组细胞增殖活性和增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01),迁移细胞数明显减少(P<0.01), S期细胞百分率和细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。与对照组比较,APOC1过表达组细胞中p-ERK、 p-AKT和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:APOC1高表达能够抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其机制可能与其抑制p-ERK、p-AKT、Bcl-2蛋白表达和促进cleaved caspase-3蛋白表达有关。

蛋白4.1R对肝细胞HL-7702增殖、凋亡以及糖酵解的影响

目的探究蛋白4.1R对肝细胞增殖、凋亡以及糖酵解的影响,并初步阐明其分子机制。方法以肝细胞株HL-7702为材料,利用CRISPR/Cas9技术构建4.1R^(-/-)HL-7702细胞株。设置对照组为正常培养的4.1R+/+HL-7702细胞,实验组为4.1R^(-/-)HL-7702细胞。细胞在培养24、48以及72 h时,分别用CCK-8及EdU-488染色,然后利用酶标仪以及流式细胞术检测细胞的增殖能力。细胞经Annexin V-FITC/PI染色后,流式细胞术检测HL-7702细胞在培养24、48以及72 h时的凋亡水平。利用生化试剂盒分别检测HL-7702细胞葡萄糖摄取量、乳酸分泌量以及ATP生成的变化。pH计检测培养48 h HL-7702细胞上清培养基的pH值。qRT-PCR检测HL-7702细胞糖酵解过程关键调节酶HK2、PFKL、PKM2以及LDHA的mRNA表达量。Western blotting检测AMPK、p-AMPK、Raptor以及p-Raptor的蛋白表达量。结果Western blotting以及基因测序结果表明4.1R^(-/-)HL-7702细胞株构建成功。与对照组相比,4.1R^(-/-)组的CCK-8和EdU-488实验结果均显示HL-7702细胞的增殖能力降低;细胞凋亡实验结果表明,4.1R^(-/-)HL-7702细胞凋亡水平升高。蛋白4.1R的缺失导致HL-7702细胞葡萄糖摄取量(P<0.05)、乳酸分泌量(P<0.001)、ATP生成(P<0.001)下降,细胞上清培养基pH值(P<0.01)升高。qRT-PCR实验结果表明糖酵解过程关键调节酶的mRNA表达量均下降(P<0.001)。相较于HL-7702细胞,4.1R^(-/-)HL-7702细胞的AMPK和Raptor蛋白表达量下降,p-AMPK和p-Raptor蛋白表达量升高。结论蛋白4.1R的缺失导致HL-7702细胞增殖能力降低、凋亡水平增加,糖酵解过程被抑制,其调控机制与下游AMPK-mTORC1信号通路的激活密切相关。

大黄素调控组蛋白乙酰化促进HpG2肝癌细胞焦亡及凋亡的发生

目的 研究天然产物大黄素是否能够影响HpG2肝癌细胞中组蛋白乙酰化水平,进而加速肝癌细胞焦亡和凋亡,为肝癌的治疗提供新的靶点。方法 CCK-8法检测不同浓度大黄素对Hp G2细胞活力的影响;生物信息学分析TCGA数据库中肝癌患者组蛋白乙酰化相关基因表达情况,验证候选基因赖氨酸乙酰基转移酶2A(KAT2A)与细胞凋亡通路的相关性;实时荧光定量PCR(q PCR)检测Hep G2细胞与L02细胞KAT2A m RNA水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大黄素对Hp G2细胞中组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白去乙酰转移酶(HDAC)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的影响;流式细胞术检测大黄素对肝癌细胞凋亡的影响;Western blot检测细胞凋亡、细胞焦亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2-相关X蛋白质(Bax)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(Caspase-1)、Gasdermin家族成员D N端(GSDMD-N)及KAT2A的表达情况。结果 大黄素能降低Hp G2细胞活性,半抑制浓度(IC_(50))95%置信区间为58.12~66.52μmol/L。与正常肝组织相比,组蛋白乙酰化相关基因m RNA水平在肝癌组织中表达增高,且KAT2A变化倍数最大[log_2(Fold Change)=2.010,P<0.01];在肝癌组织中,KAT2A m RNA的表达与细胞凋亡通路呈负相关(r_s=-0.230,P<0.01)。与L02细胞相比,KAT2A m RNA在Hep G2中表达升高(P<0.05);与对照组相比,大黄素干预组HAT和HDAC的表达水平下降,IL-18、IL-1β表达水平水平增高,细胞凋亡率升高,KAT2A、BAX的表达降低,Bcl-2、NLRP3、GSDMD-N及Caspase-1表达水平升高(P<0.05)。结论 大黄素可抑制肝癌细胞活力,加速细胞凋亡和焦亡,其机制可能与调控KAT2A表达相关。

槐耳颗粒对索拉非尼耐药的肝细胞癌细胞凋亡的影响研究

目的探讨槐耳颗粒对索拉非尼耐药的肝细胞癌(HCC)细胞生长的抑制作用及其分子机制。方法利用梯度浓度槐耳颗粒处理HCC细胞,分析槐耳颗粒对索拉非尼耐药的HCC细胞增殖、迁移和侵袭的效果。采用生物信息学手段分析微小RNA-31-5p(miR-31-5p)与sprouty相关EVH1域蛋白1(SPRED1)的可能互作关系。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HCC细胞中miR-31-5p、SPRED1的表达;采用CCK-8、克隆形成、划痕愈合、Transwell以及流式细胞术实验分别检测细胞活力、增殖、迁移、侵袭和凋亡;采用RNA免疫沉淀(RIP)实验和双荧光素酶实验验证miR-31-5p与SPRED1的结合关系。结果槐耳颗粒可以显著抑制索拉非尼耐药的HCC细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。生物信息学分析发现miR-31-5p在HCC中高表达,而槐耳颗粒可以下调miR-31-5p的表达,抑制索拉非尼耐药的HCC细胞的增殖和转移,并诱导细胞凋亡;miR-31-5p可靶向抑制SPRED1的表达。SPRED1在HCC中表达下调,过表达SPRED1可以逆转miR-31-5p过表达对索拉非尼耐药的HCC增殖和转移的促进作用。结论槐耳颗粒通过miR-31-5p/SPRED1轴抑制索拉非尼耐药的HCC转移,表明槐耳颗粒有潜力作为治疗HCC的新型药物。

白藜芦醇对铁超载大鼠肝星状细胞凋亡的影响

目的:研究白藜芦醇(RES)对铁超载大鼠肝星状细胞凋亡的影响。方法:体外培养大鼠肝星状细胞细胞系HSC-T6,使用25μmol/L的柠檬酸铁铵(FAC)刺激24 h建立铁超载模型,将细胞分为对照组、铁超载模型组(25μmol/L FAC)、低剂量RES(L-RES)组(3.12μmol/L RES+25μmol/L FAC)、中剂量RES(M-RES)组(6.25μmol/L RES+25μmol/L FAC)、高剂量RES(H-RES)组(12.5μmol/L RES+25μmol/L FAC)和去铁铵(DFO)组(50μmol/L DFO+25μmol/L FAC)。采用CCK-8法测定HSC-T6细胞活力;采用免疫荧光法测定细胞凋亡及活性氧(ROS)水平;通过普鲁士蓝染色观察HSC-T6细胞中铁含量的变化;通过ELISA法测定各组HSC-T6细胞上清液中金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达水平;Western blot法检测HSC-T6细胞中I型胶原蛋白(Col-I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、caspase-3及Bax蛋白的表达水平。结果:CCK-8实验表明RES可抑制铁超载HSC-T6细胞活力(P<0.05)。免疫荧光显示RES可促进HSC-T6细胞凋亡,抑制ROS生成。普鲁士蓝染色显示RES可以减少铁超载HSC-T6细胞铁含量。ELISA结果表明RES可升高铁超载HSC-T6细胞中MMP-13的水平,降低TIMP-1的表达水平(P<0.05)。Western blot结果显示RES降低铁超载HSC-T6细胞中Col-I和α-SMA的表达,并上调caspase-3及Bax蛋白的表达水平(P<0.05)。结论:RES可以上调体外铁超载大鼠HSC-T6细胞中caspase-3及Bax的表达,促进细胞凋亡,抑制该细胞活化。

促进肝星状细胞凋亡的抗肝纤维化药物的研究进展

肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的发生、发展和消退过程中均发挥着重要作用,通过特异性诱导活化的肝星状细胞(aHSC)凋亡,既可减少细胞外基质产生,又可促进其降解,有助于逆转肝纤维化。研究发现,多种药物可通过线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激途径等诱导aHSC凋亡。该文就诱导aHSC凋亡的药物及其作用机制作一综述,以期为抗肝纤维化药物的研发提供参考。

连翘酯苷A对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究连翘酯苷A(FA)对肝星状细胞增殖活化及凋亡的影响。方法 以人肝星状细胞(LX-2)作为实验对象,采用血小板衍生生长因子(PDGF)-BB模拟肝纤维化微环境,实验分为对照组、PDGF-BB组、FA组、PDGF-BB+FA组。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测LX-2细胞活力;采用油红O检测细胞内脂滴的情况;采用免疫荧光染色检测细胞内α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;采用蛋白质印迹技术(Western Blot)检测纤维化相关标志蛋白[α-SMA、α1-I型胶原蛋白(COL1A1)]和凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2蛋白(BCL-2)、剪切的-腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PARP)、BCL-2相关X蛋白(BAX)、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-CASPASE-3)]的表达;采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 FA处理后LX-2细胞活力明显下降,且呈剂量依赖性;油红O实验结果显示,与PDGF-BB组比较,FA组细胞内脂滴数量较多;免疫荧光染色结果显示,与PDGF-BB组相比,FA组细胞内α-SMA荧光斑点的数量减少;WesternBlot实验结果显示,FA组α-SMA、COL1A1、BCL-2蛋白表达减少,cleaved-PARP、BAX、cleaved-CASPASE-3蛋白表达增加。结论 FA可抑制肝星状细胞的增殖、活化,促进凋亡,改善PDGF-BB诱导的体外肝纤维化。

柚皮素通过激活凋亡信号抑制肝星状细胞活化

目的研究柚皮素对肝星状细胞活化的体外抑制作用及可能机制。方法以人正常肝细胞LO2为参照,在MTT法筛选药物干预浓度的基础上,考察柚皮素(Western blot实验和台盼蓝染色实验浓度为10、20、40μmol/L,免疫荧光实验浓度为40μmol/L)对人肝星状细胞LX2肝纤维化标志物蛋白[胶原纤维Ⅰ(collagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]及mRNA(collagenⅠ前体α1-pro collagenⅠ、α-SMA)表达、细胞凋亡及凋亡相关蛋白[Bcl-2、Bax、剪切的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)]表达的影响;选择凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK,FMK)、铁死亡通路抑制剂ferrostatin-1、程序性死亡通路抑制剂necrostatin-1对上述作用机制进行验证。结果柚皮素可显著下调LX2细胞中collagenⅠ(柚皮素10μmol/L除外)、α-SMA蛋白及α1-pro collagenⅠ(柚皮素10μmol/L除外)、α-SMA mRNA的表达(P<0.05),可诱导LX2细胞凋亡并提高其凋亡比例,可显著下调Bcl-2蛋白的表达并上调Bax(柚皮素10μmol/L除外)、cleaved caspase-3(柚皮素10μmol/L除外)蛋白的表达;FMK可逆转柚皮素对LX2细胞的上述作用(P<0.05)。结论柚皮素可通过激活肝星状细胞LX2的凋亡信号来抑制其活化,从而发挥对肝纤维化的改善作用。

miR-29c-3p/IGF1分子轴对肝星状细胞活化,增殖和凋亡的作用机制

目的探讨miR-29c-3p通过IGF-1对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化,增殖和凋亡的影响。方法原代培养小鼠HSCs,并通过免疫荧光检测HSCs标志物ɑ-SMA表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-29c-3p和IGF-1的靶向关系。TGF-β激活HSCs,并且外源性调控miR-29c-3p和IGF-1的表达水平后,分别采用Westernbolt,CCK-8,克隆形成实验和流式细胞术检测活化HSCs中活化相关蛋白(ɑ-SMA,DDR2,FN1,ITGB1和GFAP)的表达,增殖,克隆形成数和凋亡。结果ɑ-SMA阳性表达表明成功分离小鼠HSCs。miR-29c-3p mimic可降低野生型IGF-1的荧光素酶活性,但是对突变型IGF-1没有影响。过表达miR-29c-3p和低表达IGF-1能减少ɑ-SMA,DDR2,FN1和ITGB1表达,增加GFAP的表达,并且降低HSCs的增殖活力和克隆形成数,上调其凋亡比例。结论miR-29c-3p通过靶向抑制IGF-1表达,进而抑制HSCs活化和增殖,并促进其凋亡。

TRAIL诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6凋亡及机制研究

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肝星状细胞凋亡情况及调控机制。方法用RT-PCR检测大鼠肝星状细胞(HSC-T6)中α-SMAmRNA和DR5mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞术检测外源性TRAIL对HSC-T6细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响;采用Western blot检测Bax、Caspase3蛋白的表达。结果培养的HSC-T6细胞表达α-SMA mRNA和DR5mRNA随作用时间的延长逐渐增加,TRAIL可以抑制其细胞增殖。TRAIL与对照组比较可以诱导活化的HSC-T6细胞凋亡明显增加(P<0.05),Western-blotting分析显示TRAIL作用下,HSC-T6细胞中的线粒体Bax蛋白、细胞浆Caspase3蛋白表达均上调。结论外源性TRAIL可诱导活化的HSC-T6细胞凋亡,可能与DR5及线粒体Bax表达上调有关。

马兰草凝胶贴剂对肝硬化腹水大鼠及其活化肝星状细胞凋亡的影响研究

目的探讨马兰草凝胶贴剂对肝硬化腹水大鼠及其活化肝星状细胞凋亡的影响。方法将雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、基质组、马兰草凝胶贴剂组和呋塞米+螺内酯组,每组10只。除空白组外,其余各组采用腹腔注射CCl 4-橄榄油混合液制备肝硬化腹水模型大鼠。造模成功后,基质组、马兰草凝胶贴剂组分别给予不含药物的基质贴和马兰草凝胶贴,每两天1次,每次1.5小时,持续8周;呋塞米+螺内酯组给予呋塞米+螺内酯混合液灌胃,每两天1次,持续8周。给药期间观察大鼠一般状态,测量腹水量、白蛋白、胶体渗透压变化。8周后麻醉处死大鼠,取材进行检测,苏木精—伊红染色法行肝组织病理学检测,Tunel-α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)双标记法检测活化肝星状细胞凋亡,免疫荧光法检测各组大鼠B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2关联X(Bcl-2 associated X,Bax)蛋白表达。结果马兰草凝胶贴剂组有效改善腹水大鼠的一般状态,腹水量显著降低,血清白蛋白、血浆胶体渗透压水平明显升高,肝细胞结构接近正常,细胞大小均匀,门管区炎性细胞浸润显著减轻,α-SMA阳性细胞表达明显减少,荧光减弱,Tunel阳性细胞表达增多,Bax表达显著升高,Bcl-2表达显著下降。结论马兰草凝胶贴剂对肝硬化腹水大鼠腹水具有治疗作用,其作用机制可能与修复肝组织病理形态和促进活化的肝星状细胞凋亡有关。