大鼠肝星状细胞系的建立及其生物学特性的研究

目的 建立并鉴定肝星状细胞 (HSC)细胞系。 方法 采用肝脏离体胶原酶灌注消化及密度梯度离心的方法分离培养大鼠的HSC ;通过体外长期传代培养后建立 1株细胞系 ,应用细胞形态学观察、细胞倍增时间测定、细胞生长曲线绘制、染色体分析、双层软琼脂培养、免疫细胞化学检测、RT PCR检测、聚硅酮膜培养法观测HSC的收缩等方法对其生物学特性进行研究。 结果 HSC细胞系已传了 78代 ,保持着肌成纤维样细胞的形态学特点。细胞倍增时间为 36 5h ;细胞的染色体众数 4 2条 ,为正常大鼠体细胞的染色体表型 ;双层软琼脂培养未见细胞克隆形成 ;免疫细胞化学检测表明 ,细胞系表达Desmin、GFAP、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α SMA、iNOS、ICAM 1、TGF α ;RT PCR检测表明 ,该细胞系表达TGF β、ICAM 1;聚硅酮膜培养法显示 ,HSC细胞系能在ET 1作用下产生收缩反应。结论 HSC细胞系符合建系标准 ,是 1株新建立的大鼠肝星状细胞系 ,命名为rHSC 99,可作为肝硬化、门静脉高压症实验研究的模型。

复方中药861对大鼠肝星状细胞系一氧化氮合酶表达及其活性的影响

目的 :研究复方中药 86 1对大鼠肝星状细胞系 (HSC T6 )一氧化氮合酶 (NOS)表达及其酶活性的影响 ,并探讨该药预防、治疗早期门脉高压的可行性。方法 :细胞密度为 1× 10 5/ml的HSC T6 接种于细胞培养皿中 ,95 %O2 ,5 %CO2 ,37℃ ,培养 2 4h进行以下分组实验 ,每组重复 6皿 ,继续培养 2 4h。 1组 :HSC T6 空白对照组 ;2组 :HSC T6 加复方中药 86 1(2mg/ml) ;3组 :HSC T6 加复方中药 86 1(4mg/ml) ;4组 :HSC T6 加复方中药 86 1(8mg/ml) ;5组 :HSC T6 加复方中药 86 1(4mg/ml)加L 硝基精氨酸甲酯 (L NAME ,4mg/ml)。采用化学比色法测定NOS活性 ,采用硝酸还原酶法测定培养液一氧化氮 (NO)水平。 4 %多聚甲醛固定细胞 2h ,采用免疫细胞化学法观察HSC T6 诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)表达。结果 :复方中药 86 1能增加HSC T6 NOS活性 (P <0 0 1) ,上清液NO水平也平行增加 (P <0 0 1) ,L NAME不能抑制复方中药86 1刺激的HSC T6 合成、分泌NO增加 (P >0 0 5 )。免疫细胞化学研究发现 ,活化的HSC T6 细胞浆有iNOS表达 ,复方中药 86 1能增加HSC T6 iNOS表达。结论 :活化HSC T6 iNOS表达阳性 ,与自分泌NO有关 ;复方中药 86 1能明显增加HSC T6 iNOS表达及其酶活性 ,NO合成、分泌增加。复方中药 86

永生大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定

目的:建立永生性大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)系. 方法:采用改良胶原酶原位灌注法消化肝脏,经Nycodenz 密度梯度离心分离、鉴定成年Sprague-Dawley大鼠的HSC. 然后通过细胞克隆建立HSC系(HSC-PQ)并传代培养.结合细胞动力学、光镜、透射电镜及免疫细胞化学技术检测HSC- PQ系的倍增时间、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结蛋白表达、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成等表型特征. 结果:分离获得的HSC约为2×107细胞/只大鼠,细胞成活率>95%,纯度>90%,培养2 wk后几乎所有HSC均已活化.在此基础上经细胞克隆所得的HSC-PQ系表型类似成纤维细胞,倍增时间约75h,可表达结蛋白、α-SMA 以及除Ⅳ型胶原外的多种ECM成分(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等),且传代过程中增生、ECM表达等特性均保持稳定.该细胞系已在体外培养32代(1 a以上),提示其具有永生性. 结论:已成功建立永生性大鼠HSC系,该细胞系的基本特征与活化的原代HSC相似.

脂质体转染TRPM7 siRNA对肝星状细胞系HSC—T6细胞增殖的影响

目的：通过利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）下调TRPM7基因的表达，研究TRPM7对大鼠肝星状细胞系HSC—T6细胞活化、增殖的影响。

HBV对肝内TGF-β1蛋白表达和人肝星状细胞系LX-2活性的影响

目的探讨HBV对肝内TGF-β1蛋白表达及人肝星状细胞系LX-2细胞活性的影响。方法运用免疫组织化学方法检测对照组(HBV阴性)和慢性乙型肝炎组肝组织内TGF-β1的表达;采用细胞培养、Western blot、MTT和Transwell实验体外观察HBV对LX-2细胞形态及活性的影响。结果慢性乙型肝炎组肝组织内TGF-β1的表达水平显著高于对照组(t=4.2268、P=0.000);在慢性乙型肝炎组,TGF-β1在肝纤维化处于S1～S2期的肝组织内表达较高,与肝纤维化S3～S4期肝组织内的表达比较差异具有显著性(t=6.9107、P=0.000)。HBV可引起LX-2细胞的形态学改变,并增加其增殖和运动迁移能力。结论 HBV主要在慢性乙型肝炎肝纤维化形成的早期阶段发挥作用。HBV感染可引起肝组织内TGF-β1蛋白表达增加和人肝星状细胞系LX-2的形态改变和活性增强。

人肝星状细胞系LX-2激活过程细胞收缩力的实时测量

肝星状细胞的细胞收缩力在肝脏损伤、炎症和纤维化的过程中起着非常重要的作用。本文提出了一种基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄微柱阵列测量人肝星状细胞系LX-2细胞收缩力的方法,以实现亚细胞级的细胞收缩力大小、方向、分布及其动态变化的测量。首先,运用二次铸模工艺制备了以玻底培养皿为基底的满足100倍物镜成像工作距离的薄微柱阵列,并对微柱表面进行亲水、压印蛋白处理,再在其上接种细胞。然后,将细胞培养在无胎牛血清(FBS)培养基中以使细胞处于静息态,再通过加入FBS的方法使细胞转变为激活态。通过图像处理技术得到不同时刻微柱顶端发生的位移,结合微柱力学仿真结果,计算得到作用在微柱上的细胞收缩力,并对细胞状态激活前后微柱的受力情况进行了分析。本研究的实验结果表明,静息态时,细胞收缩力最大为20 nN;加入FBS激活细胞后,细胞收缩力最大增强至110 nN。本文所述方法可测量单个LX-2细胞在静息态和激活态时的收缩力,对肝纤维化引发的慢性肝病的病理研究、药物筛选具有重要的意义。

脂联素通过激活p38MAPK信号通路调节大鼠肝星状细胞MMP-13及TIMP-1表达

目的观察外源性脂联素对体外培养的大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)细胞脂联素受体1(AdipoR1)表达的调节作用及对细胞内p38MAPK信号通路的影响,并观察该通路是否参与调节脂联素对HSC细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响。方法 MTT法观察不同浓度脂联素对HSC生长的影响。荧光定量PCR法检测脂联素作用下HSC-T6细胞AdipoR1、MMP-13、TIMP-1的mRNA表达情况。Western blotting方法检测脂联素作用下HSC-T6细胞信号蛋白p38MAPK的活化及活性和AdipoR1、MMP-13、TIMP-1的蛋白表达情况。结果 0.5μg/mL～2.0μg/mL脂联素处理HSC细胞,各组细胞增生无明显变化。0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL脂联素作用下AdipoR1mRNA和蛋白表达增加。1.0μg/mL脂联素处理HSC后,p38MAPK激酶磷酸化水平随时间增加而增高,在120min达最大值,之后又开始下降。不同浓度脂联素处理HSC120min后,p38MAPK激酶磷酸化水平均增加,并具有浓度依赖性。p38MAPK抑制剂SB203580可抑制p38MAPK激酶的磷酸化及活性。脂联素处理组HSC细胞MMP-13mRNA及蛋白表达均较对照组明显增加,而TIMP-1mRNA及蛋白表达较对照组降低,而SB203580可以抑制这种效应。结论脂联素可上调活化肝星状细胞AdipoR1的表达,通过激活p38MAPK信号通路,调节HSC细胞MMP-13及TIMP-1的表达。

TRPM7对TRAIL诱导的大鼠肝星状细胞凋亡的影响

目的：观察瞬时受体电位通道7（TRPM7）在大鼠肝星状细胞系HSC—T6的表达。

miRNA-27b对人星状细胞系脂代谢与迁移能力的影响

目的探讨在人肝星状细胞系中miR-27b基因表达异常对LX-2细胞的脂滴沉积与迁移能力的影响。方法转染干预miR-27b的表达,油红染色与划痕实验检测LX-2细胞的脂滴沉积与迁移能力,荧光定量PCR检测靶基因RXRa的表达。结果 miR-27b在人肝星状细胞系LX-2细胞活化过程中表达升高,miR-27b的模拟物可以促进LX-2细胞的迁移、减小胞质内脂滴沉积;相反,miR-27b抑制物可以减弱LX-2细胞的迁移,增加胞质内脂滴沉积。荧光定量PCR结果显示RXRa在转染miR-27b模拟物表达降低,抑制物无明显变化。结论上调miR-27b的表达可能是通过靶基因RXRa促进LX-2细胞的迁移,减少细胞胞质内的脂滴沉积。

Smad7质粒转染对肝星形细胞α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因表达的影响

目的:研究上调Smad7表达对肝星形细胞(HSC)α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原基因转录的作用.方法:应用Fugene6介导Smad7质粒转染体外培养的HSC-T6细胞.继续培养48 h.同时使用实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR),逆转录酶链式反应(RT-PCR)方法检测Smad7质粒组和正常对照组、空载质粒对照组α(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原mRNA水平.结果:与正常对照组和空载质粒对照组相比,Smad7质粒转染HSC-T6细胞48h后,Smad7 mRNA水平显著增高(1.29±0.18 vs 0.11±0.02,0.13±0.02,均P<0.01),α1(Ⅰ)前胶原mRNA表达明显下降(0.10±0.01 vs 1.18±0.15.1.07±0.12,均P<0.01),但α1(Ⅲ)前胶原基因表达无明显改变(0.72±0.00 vs 0.70±0.01,0.75±0.0l,均P>0.05).结论:Smad7能明显抑制HSC细胞α1(Ⅰ)前胶原mRNA转录.

白花丹醌对TGF-β_1刺激人肝星状细胞α-SMA表达的影响

目的:研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞HSC-LX2α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白表达的影响。方法:体外培养HSC-LX2,随机设立空白组,TGF-β1刺激的模型组,TGF-β1+白花丹醌2.0μmol·L-1高剂量组,TGF-β1+白花丹醌1.5μmol·L-1中剂量组和TGF-β1+白花丹醌1.0μmol·L-1低剂量组,各药物与细胞孵育72 h后,采用RT-PCR检测各组HSC-LX2α-SMA mRNA的表达,采用免疫细胞化学方法(ICC)检测HSCLX2中α-SMA蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组α-SMA mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,高、中剂量组HSC-LX2细胞中α-SMA mRNA的表达明显降低(P<0.01);免疫细胞化学结果显示白花丹醌高、中剂量组对HSC-LX2细胞α-SMA蛋白的表达有显著地抑制作用(P<0.05),尤以高剂量组更明显(P<0.01)。结论:白花丹醌能抑制HSC-LX2的活化和增殖,其机制之一可能是从mRNA水平和蛋白水平抑制α-SMA的表达,从而发挥其抗肝纤维化作用。

氧化应激对肝星状细胞转录因子Nrf2核转位的影响

目的:研究细胞转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)在大鼠肝星状细胞系HSC-T6中的表达及氧化应激对其核转位的影响。方法:将大鼠肝星状细胞(HSC-T6)分成空白对照组和氧化应激组,氧化应激组加入100mU/ml葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GO)干预2h制备细胞氧化应激模型,空白对照组予以DMEM正常培养未进行GO干预。Western blot方法检测Nrf2总蛋白及核蛋白的变化,细胞免疫化学法观察HSC-T6细胞Nrf2核转位情况,流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化,分光光度法检测细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平。结果:1氧化应激组ROS及MDA水平较空白对照组显著升高(P<0.01)。2WB显示Nrf2总蛋白在两组的表达无显著差异,而Nrf2核蛋白在空白对照组中无明显表达,在氧化应激组表达明显增加;ICC显示空白对照组中Nrf2蛋白仅在胞浆中表达;而氧化应激组胞核和胞浆中均可见Nrf2蛋白表达。3氧化应激组GSH水平较空白对照组显著升高(P<0.01)。结论:在氧化应激过程中Nrf2发生核转位从而发挥其生物学功能。

大麻素CB2受体激动剂AM1241对肝星状细胞影响

目的探讨大麻素Ⅱ型受体(CB2)激动剂AM1241对大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)影响及其机制。方法将HSC-T6细胞随机分为对照组、氧化应激组及20、80μmol/L AM1241干预组;对照组正常培养,氧化应激组用含100 m U/L葡萄糖氧化酶(GO)完全培养液培养2 h;AM1241干预组分别加入20、80μmol/L的AM1241干预3 h后,再加入100 m U/L GO干预2 h;细胞免疫化学染色法检测HSC-T6细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;酶联免疫法检测HSC-T6细胞培养液上清中I型胶原(Col I);硫代巴比妥酸法检测丙二醛含量;氮蓝四唑法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力;Western blot检测HSC-T6细胞核转录相关因子(Nrf2)总蛋白与核蛋白含量。结果与对照组比较,氧化应激组HSC-T6细胞胞浆中α-SMA、Col I表达量均增多(P<0.05);与氧化应激组比较,AM1241干预组HSC-T6细胞胞浆中α-SM A、Col I表达量均减少(P<0.05);与对照组比较,氧化应激组HSC-T6细胞中丙二醛含量上升,SOD活性下降(P<0.05);与氧化应激组比较,AM1241干预组HSC-T6细胞丙二醛含量下降,SOD活性上升(P<0.05);对照组、氧化应激组及20、80μmol/L AM1241干预组HSC-T6细胞中Nrf2总蛋白表达量分别为(0.62±0.021)、(0.60±0.015)、(0.59±0.020)、(0.61±0.032),各组差异无统计学意义(P>0.05);与氧化应激组比较,AM1241干预组Nrf2核蛋白表达量均增加(P<0.05)。结论大麻素CB2受体激动剂AM1241可抑制氧化应激作用下HSC-T6细胞活化,其机制可能与AM1241促进HSC-T6细胞中Nrf2发生核内转移,增加抗氧化作用有关。

人脂联素真核表达质粒构建及其在LX-2中的表达

目的构建人全长脂联素真核表达质粒,转染人肝星状细胞系(LX-2),观察其表达及分泌情况,为脂联素在肝纤维化作用的基础及临床研究提供实验数据。方法提取人脂肪组织mRNA,用RT-PCR扩增出添加酶切位点的人全长脂联素基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及空载体质粒P7,将酶切后的片段进行连接、转化构建质粒。用FuGENE HD将构建成功的质粒转染LX-2细胞,用免疫荧光观察其转染效率及细胞定位,Western blotting检测脂联素蛋白表达。结果酶切及测序证实成功构建人全长脂联素真核表达质粒,免疫荧光检测转染效率约为40%,Western blotting检测到30000处存在目的蛋白表达,与预期相对分子质量一致。结论成功构建的人全长脂联素真核表达质粒能有效转染LX-2细胞及表达脂联素蛋白。

咖啡因对乙醛诱导的HSC-T6中TGF-β1,CTGF信号转导通路的影响

目的探讨咖啡因(caffeine)对乙醛诱导的大鼠肝星状细胞系(Hepatic Stellate Cell-T6,HSC-T6)中转化生长因子-β1(Trans-forming Growth Factor-β1,TGF-β1),结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)信号转导通路的影响。方法实验设正常组(常规培养),模型组及腺苷受体(Adenosine Receptor,AR)调节剂干预组。分别给予caffeine(4 mmol.L-1)[1-2],腺苷A2A受体拮抗剂ZM241385(1μmol.L-1)[3],腺苷A2A受体激动剂CGS21680(1μmol.L-1)[3],caffeine+CGS21680,ZM241385+CGS21680与HSC-T6共同培养,1 h后加入终浓度200μmol.L-1的乙醛刺激(每12 h补充1次),继续培养48 h。采用免疫细胞化学法检测HSC-T6中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,RT-PCR法检测TGF-β1和CTGF mRNA水平,Western blot方法检测各组HSC-T6中CTGF蛋白表达。结果与模型组比较,caffeine及ZM241385均显著降低HSC-T6中α-SMA,TGF-β1和CTGF的表达,而caffeine及ZM241385合用CGS21680上述作用有所逆转。结论 Caffeine能够显著降低乙醛诱导的HSC-T6活化,并且显著抑制HSC-T6中TGF-β1和CTGF的表达水平,其机制可能与拮抗腺苷A2A受体介导的信号通路有关。

抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA设计、合成及活性鉴定

目的 设计、合成及筛选高效抗肝纤维化关键基因———结缔组织生长因子 (CTGF)的小分子干扰RNA(siRNA)。方法 应用RNA设计软件 ,模拟SD大鼠CTGFmRNA二级结构 ,设计并合成针对CTGFmRNA 483、885及946位点的三对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,转染肝星状细胞系 (HSCT6) ,以空白及转染非特异siRNA(与CTGFmRNA无同源性的 2 1ntsiRNA)作为对照 ,应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测HSCT6细胞CTGFmRNA表达。结果 与对照相比 ,转染siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA明显下调 ,在 5 0～ 2 0 0nmol/L范围 ,CTGFmRNA下调幅度呈浓度依赖性增加 ,以 483siRNA 2 0 0nmol/L最显著 ,转染非特异siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平无明显变化。转染 483siRNA的HSCT6细胞 2 4、48及 72hCTGFmRNA分别较对照下调 91%± 2 %、65 %± 3 % (t =78.82 ,3 7.5 3 ,P均 <0 .0 1)和 10 %± 7% (t =2 .5 5 ,P =0 .0 6) ,在 2 4～ 72h范围 ,CTGFmRNA下调幅度呈时间依赖性降低。结论 成功筛选到能高效阻抑CTGF表达的 483siRNA ,其有效阻抑时间约 72h ,有望通过介导CTGFmRNA剪切而抑制肝纤维化的发生与发展 。