沉默转化生长因子β1对肝星状细胞-T6生长及增殖的影响

目的观察沉默转化生长因子β1(TGFβ1)对肝星状细胞(HSC)-T6生长及增殖的影响。方法用具有高效感染力的TGFβ1 shRNA慢病毒液感染HSC-T6细胞,以未经感染或经空病毒感染的HSC-T6细胞作对照。倒置荧光显微镜下观察HSC-T6细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达变化;CCK-8法检测TGFβ1 shRNA慢病毒对HSC-T6细胞生长及增殖的影响;RT-PCR和Western blotting分别检测HSC-T6细胞TGFβ1及增殖细胞核抗原(PCNA)基因及其编码蛋白的表达,并予以定量分析。结果经TGFβ1 shRNA慢病毒感染的HSCT6细胞显著表达GFP。CCK-8法检测结果显示:经TGFβ1 shRNA慢病毒感染的HSC-T6细胞的生长及增殖慢于对照细胞,培养48 h后差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR和Western blotting检测结果显示:TGFβ1shRNA慢病毒能有效沉默HSC-T6细胞TGFβ1,并下调其核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达,与对照细胞的差异有统计学意义(P<0.01)。结论沉默TGFβ1能明显抑制HSC-T6的生长及增殖,并下调其核抗原PCNA的表达。

慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶过表达对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的探讨携带脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase,POP)基因的慢病毒转染大鼠肝星状细胞系-T6(hepatic stellate cellsT6,HSC-T6)对其生物学功能的影响,以揭示其在肝脏炎症与纤维化发生、发展中的作用。方法采用大鼠HSC-T6作为研究对象,设计合成携带大鼠POP基因的慢病毒,转染HSC-T6;通过ELISA方法检测各组HSC内Ac-SDKP水平;Real-time-PCR法检测各组HSC内相关基因表达量变化(POP、TGF-β1、α-SMA、MCP-1、Col I);Western blotting方法检测各组HSC中相关蛋白表达变化(POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ);CCK-8和流式细胞术检测转染POP对HSC增殖和凋亡的影响。结果慢病毒能高效感染HSC-T6并表达有活性的POP蛋白,与正常对照组及空病毒组相比,POP慢病毒感染的细胞内Ac-SDKP明显升高,Smad7、PPAR-γ蛋白表达显著升高,而α-SMA表达显著下降;POP慢病毒感染的细胞内MCP-1及α-SMA mRNA表达显著下调;此外,POP可促进HSC-T6增殖生长,而对HSC-T6凋亡无影响。结论 POP在HSC内可能发挥抗炎、抗纤维化作用,其机制可能通过促进Smad7及PPAR-γ的表达,抑制MCP-1及α-SMA的表达而发挥作用。

肾上腺髓质素对大鼠肝星状细胞表达细胞周期蛋白的影响

目的探讨肾上腺髓质素(ADM)对活化肝星状细胞(HSC)表达细胞周期蛋白的影响。方法采用不同浓度的ADM对HSC-T6细胞进行干预12h、24h和48h。采用MTT法检测HSC-T6细胞增殖;采用SABC法检测细胞增殖核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21waf1的表达。结果在ADM10-7mol/L浓度下作用12h,24h,48h,细胞生长抑制率逐渐增加(分别是7.88%,17.58%,18.79%);在ADM10-7mol/L作用24h时,HSC的PCNA、cyclin D1和P21waf1表达的平均光密度分别为0.387±0.023、0.454±0.029和0.508±0.011,而对照组分别为0.246±0.030、0.209±0.014和0.401±0.033(t值分别为5.149、5.752和5.299,P<0.05),差异有显著性。相关性分析表明,PCNA和cyclinD1的变化呈正相关趋势(r=0.834,P<0.05),而PCNA和P21waf1呈负相关趋势(r=-0.770,P<0.05),cyclinD1和P21waf1呈负相关趋势(r=-0.796,P<0.05)。结论肾上腺髓质素可抑制HSC-T6细胞增殖。ADM作用HSC可能通过调控HSC的细胞周期,抑制PCNA和cyclinD1表达,促进P21waf1表达,从而发挥抑制HSC增殖作用。

紫花牡荆素诱导肝星状细胞凋亡的作用机制

目的:探讨紫花牡荆素(casticin)促进肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)-T6凋亡的作用机制.方法:用终浓度为0、0.5、1.0、2.0μmol/L的Casticin作用于HSC-T6,于12、24、48 h后采用MTT法检测HSC-T6增殖抑制率;24 h后收集各组细胞,流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;DNA琼脂糖凝胶电泳法检测HSC-T6凋亡;RTPCR法检测促凋亡基因FAS/FASL mRNA及抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达;免疫组织化学法检测凋亡蛋白Caspase3的表达.结果:MTT法检测显示,Casticin对HSC-T6有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系;流式细胞仪检测HSC-T6凋亡,发现2.0μmol/L的Casticin作用48 h后,HSC-T6凋亡率达到最大值55.70%±5.56%,各药物组凋亡率与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).DNA琼脂糖凝胶电泳法检测HSC-T6凋亡,显示有特征性的DNA梯度带形成.RT-PCR法检测促凋亡基因FAS/FASL mRNA表达明显上调,而抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达下调.免疫组织化学法检测凋亡蛋白Caspase3的表达明显增加,当Casticin浓度2.0μmol/L作用48 h,其表达率71.33%±2.68%,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论:Casticin诱导HSC-T6细胞凋亡的机制可能是通过上调Fas/FasL基因表达,下调Bcl-2,促使线粒体通透性增加,再激活Caspase3蛋白诱发细胞凋亡.

毛菊苣中母菊素的体外抗肝纤维化作用

目的探讨毛菊苣中分离得到的母菊素(化学名:8-去乙酰母菊素-8-O-硫酸盐,192号)体外对HSC-T6细胞增殖的抑制性及对TGF-β_(1)/Smad信号通路转导作用。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力、RT-PCR检测192号化合物对HSC-T6细胞Smad2、Smad3、Smad7和TGF-β_(1)的mRNA表达影响,Western blotting检测TGF-β_(1)、Smad3和Smad7的蛋白表达水平。结果MTT法测定细胞增殖结果显示,192号可显著抑制HSC-T6的增殖。RT-PCR表达结果显示,TGF-β_(1)刺激HSC-T6细胞24 h/48 h时,192号能有效抑制Smad2、Smad3和TGF-β_(1) mRNA表达水平以及上调Smad7 mRNA表达,且24 h效果更好。Western blotting实验结果表明192号能够有效抑制TGF-β_(1)、Smad3的蛋白表达以及上调Smad7蛋白的表达。结论192号化合物可以通过阻断TGF-β/Smad信号转导通路,从而抑制HSC-T6的激活,发挥抗纤维化作用。192号化合物可能是一种潜在的抗肝纤维化药物。

郁金含药血清对HSC-T6细胞增殖抑制作用的影响

目的:观察郁金含药血清对肝星状细胞-T6(hepatic stellate cell-T6,HSC-T6)细胞增殖抑制的研究。方法:25只SD大鼠随机分5组:郁金含药血清高剂量组、中剂量组、低剂量组(16.2 g·kg-1、8.1 g·kg-1、4.0 g·kg-1),秋水仙碱组(5g·kg-1)以及空白组(给予等体积生理盐水),连续灌胃给药4 d后,于第4天一次性给药1 h后,乙醚麻醉腹主动脉取血制备含药血清;将HSC-T6细胞分为6组,郁金含药血清高剂量组、中剂量组、低剂量组,空白组、秋水仙碱组、阴性对照组(加入等体积的PBS代替大鼠血清),分别取用体积分数5%、10%、20%的含药血清,同时作用于各组HSC-T6细胞24 h、48 h、72 h后,采用四氮噻唑蓝法在酶标仪(490 nm波长)上检测各组OD值,分别计算其增殖率和抑制率。结果:与阴性对照组比较,除作用24 h、体积分数5%组外,大鼠血清可以明显加速HSC-T6细胞的增殖速度,其增殖率与大鼠血清含量呈正相关。与空白组比较,除作用24 h、体积分数5%含药血清各剂量组、低剂量20%组以及秋水仙碱20%组没有明显抑制作用外,其余各郁金剂量组均有增殖抑制作用,其中体积分数10%组的抑制效果明显高于体积分数20%组(P<0.05)。作用48 h后,各干预含药血清的3个浓度组均有明显抑制作用,其中郁金体积分数10%组的抑制效果明显高于其他体积分数组(P<0.05);作用72 h后,除秋水仙碱组外,各郁金剂量组均有明显抑制作用,其中含药血清体积分数10%组的抑制效果明显高于其他体积分数组(P<0.01)。结论:大鼠郁金含药血清可以明显加速HSC-T6细胞的增殖;郁金含药血清在体外可以有效抑制HSC-T6细胞的增殖,但抑制率与含药血清体积分数、作用时间呈非线性关系,抑制率最为显著的是含药血清体积分数10%,作用时间48 h。