丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。

甲型病毒性肝炎的早期诊断──微量打点免疫结合法

目的建立一种简便快速的检测甲型肝炎急性期血清中的IgM水平的方法．方法用微量打点免疫结合法，测定正常人血清中IgM和IgM－HRP的使用效价；分别用微量打点免疫结合法和放免法检测114例甲型肝炎患者和48例非甲肝患者血清中的IgM水平．结果微量打点免疫结合法测定正常人血清中IgM和IgM－HRP的使用效价分别为1：1000和1：16M；放免法测定114例甲肝患者血清中IgM水平为阳性，微量打点免疫结合法测定有112例阳性；微量打点免疫结合法和放免法测定48例非甲肝患者血清IgM水平的结果紊合，均为阴性；放免法测定时间为Zd，微量打点免疫结合法测定时间6h．结论在测定甲肝患者血清中IgM水平时，微量打点免疫结合法和放免法的阳性符合率和阴性符合率分别为98．24％和100％；微量打点免疫结合法比放免法更简单，快速，可在临床推广应用．

丙型肝炎患者血清中高变区1(HVR1)抗体的检测与分析

目的 了解丙型肝炎患者体内抗ＨＶＲ１ 的产生情况，并探讨其与病情发展及预后的关系．方法 用含ＨＶＲ１ 序列的合成肽对４５ 例急、慢性肝炎患者血清中抗ＨＶＲ１ 作了ＥＬＩＳＡ 检测，并对所有血清作ＨＣＶＲＮＡ 检测．结果 急性丙型肝炎患者血清中抗ＨＶＲ１ 阳性率为７０－６ ％ ，与慢性丙型肝炎患者早期血清（１２－５ ％ ） 相比差异显著性（ Ｐ＜ ０－０５） ，而且两者的平均抗体滴度相差亦非常显著（４－２ ±０－６ ｖｓ ２－８ ±０－７ ，Ｐ＜ ０－０１） ． 慢性丙型肝炎现症患者血清抗ＨＶＲ１ 的阳性率为７２－７ ％ ，其中抗ＨＶＲ１ 阳性血清中ＨＣＶＲＮＡ 的阳性率也很高（７５－０ ％ ） ．结论 ＨＣＶ 感染早期抗ＨＶＲ１ 的产生及其滴度的高低可能与疾病的转归有关；慢性丙型肝炎患者体内抗ＨＶＲ１ 的存在可能反映了ＨＶＲ１ 变异引起的免疫逃避．

慢性丙型肝炎患者HCV不同基因片段抗体应答与脂代谢关系

目的:探讨慢性丙肝患者HCV感染与脂质代谢的关系及特点。方法:用酶联免疫法检测实验组慢性丙肝患者HCV不同基因片段抗体,并以羊抗人Apo-B血清分离其Apo-B,用PCR法检测Apo-B中HCV-RNA,同时作血脂监测。另设健康人和乙肝病例对照。结果:实验组病例HCV不同基因片段抗体呈现6种分布模式,其血清中均检出HCV-RNA较高载量,相应的Apo-B中(除1例阴性外)均有HCV-RNA表达,血清LDL、Apo-B等水平值显著低于对照组。两对照组血清及Apo-B中无HCV-RNA表达,且不同基因片段抗体阴性。结论:慢性丙肝患者HCV不同基因片段抗体应答与HCV复制密切相关,与Apo-B携带密切相关;其HCV-C和HCV-NS4、HCV-NS5与不同组分载脂蛋白相互作用,可能共同干扰脂质代谢。

自身免疫性肝病诊断中自身抗体检测的临床意义

目的:探讨自身免疫性肝病诊断中自身抗体检测的临床意义。方法:采用酶联免疫吸附法和免疫印迹法分别检测自身免疫性肝病中的抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA-M2)、抗肝/肾微粒抗体I型(LKM-1)、抗可溶性肝抗原(SLA)、抗可溶性酸性核蛋白抗体(Sp100)、抗核膜糖蛋白抗体(gP210)和抗肝细胞浆I型抗原抗体(LC-1)。结果:ANA在原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性肝炎(AIH)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、HBV、HCV及正常对照组中的阳性率分别是68.8%、88.2%、40.0%、5.0%、10.0%、3.3%。AIH组的LKM-1、SLA和LC-1抗体阳性检出率17.6%、5.9%和11.8%,PBC组AMA-M2和gP210及SP100抗体的阳性检出率91.3%、26.3%及18.7%。HCV组检出1例LKM-1抗体阳性,阳性率5.0%。PSC组、HBV组及正常对照组未检出阳性。自身免疫性肝病组中AIH和PBC的阳性率明显高于其它组,经统计学分析差异有显著性。结论:自身免疫性肝病的诊断及鉴别诊断中,自身抗体检测有重要意义。

乙型肝炎患者血清HBeAg模式与HBVDNA负荷的相关性初探

目的:探讨慢性乙型肝炎HBeAg模式与HBVDNA负荷的相关性。方法:检测40例乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷和其HBeAg模式。结果:当乙型肝炎患者血清HBVDNA含量为A、C级时,出现HBeAg阳性模式中病毒水平低及HBeAg阴性模式病毒水平高现象,HBeAg阳性模式与HBeAg阴性模式者差异不显著,血清HBVDNA负荷和其HBeAg模式无相关性;当乙型肝炎患者血清HBVDNA含量为B级时,HBeAg阳性模式HBV-DNA载量显著高于HBeAg阴性模式,HBeAg阳性模式与HBeAg阴性模式者差异显著,血清HBVDNA负荷和其HBeAg模式有相关性。结论:当乙型肝炎患者血清HBVDNA含量为A、C级时,血清HBVDNA负荷和其HBeAg模式无相关性;当HBVDNA含量为B级时,乙型肝炎患者血清HBVDNA负荷和其HBeAg模式有相关性。

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。

丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆及序列比对分析

目的:研究HCV N S5A区基因的结构与功能,为提高干扰素(IFN)治疗HCV感染的有效性提供依据,及为建立以N S5A蛋白做抗原的新一代诊断试剂盒,提高HCV感染检出率作出有益的尝试。方法:以含HCV 1b全长cDNA的质粒HCV 17为模板,利用巢式PCR扩增出一段长约500bp的cDNA片段,以此基因片段作为目的基因,进行T-A克隆,构建PMD 18-T-N S5A。结果:经酶切及测序证实,PMD 18-T-N S5A质粒中的插入基因片段为HCV 1b N S5A区部分基因,与HCV标准株HCV J序列进行比对分析,核苷酸和氨基酸序列的同源性均为90%以上,并且该区段包含了干扰素敏感决定区(ISDR)。结论:建立HCVN S5A基因片段稳定的无性繁殖系,并进行同源性分析对研究ISDR序列与IFN疗效的关系是非常重要的;通过基因重组表达N S5A蛋白,可用于HCV诊断试剂盒的研究。

乙型肝炎病毒核心基因启动子变异对HBeAg表达及病情的影响

目的:研究乙型肝炎病毒核心基因启动子(HBVBCP)变异对HBeAg表达及病情的影响。方法:采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对176例HBV慢性感染者血清进行检测HBVBCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764G→A联合突变。采用ELISA检测技术,检测患者血清HBV标志物。结果:在176例HBV慢性感染者中检出HBVBCP区T1762A1764G变异者73例,HBVBCP变异的阳性率为41.5%,HBVBCP变异在HBeAg阴性病例的阳性率为49.4%,显著高于HBeAg阳性病例的阳性率33.3%。HBVBCP双变异在慢性乙型肝炎轻、中、重度组,肝炎肝硬化组,慢性重症肝炎组和原发性肝癌组的阳性率分别为28.0%、31.4%、34.2%、39.4%、60.0%和70.0%。各型肝病与HBVBCP变异的阳性或阴性进行相关分析,结果有显著性差异。结论:本组病例HBVBCP变异的阳性率为41.5%,变异可引起HBV感染者的HBeAg阴转。HBVBCP变异与HBV慢性感染的临床类型呈正相关,随着病情加重,BCP变异的阳性率有增高趋势。

肿瘤患者乙型肝炎HBsAg与HBsAb同时阳性的因素分析

目的:探讨有些肿瘤患者HBsAg和HBsAb同时阳性的发生原因。方法:采用ELISA法检测门诊及住院患者标本,收集HBsAg和HBsAb同时阳性的检测结果,分析其存在的模式。结果:肿瘤患者HBsAg和HBsAb同时阳性主要有三种模式。结论:HBsAg和HBsAb同时阳性有多种原因引起。

α-干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎血清IL-17水平的动态检测

目的:探讨IL-17在HBeAg阳性慢性乙型肝炎及其α-干扰素抗病毒过程中可能的作用及意义。方法:采用酶联免疫吸附法测定20例HBeAg阳性慢性乙型肝炎肝炎患者及11例健康对照者血清中的IL-17的水平,并对这20例患者干扰素治疗不同时间点的血清IL-17、肝功、HBeAg定量及HBVDNA定量进行检测。结果:HBeAg阳性慢性乙肝患者血清IL-17较健康人无明显升高;α-干扰素治疗后,应答组血清IL-17在18周后出现明显升高,而无应答组血清IL-17呈现水平波动;应答组中HBeAg转阴者较未转者血清IL-17水平在18周升高明显。结论:Th17细胞通过分泌IL-17可能参与HBeAg阳性慢性乙肝患者α-干扰素治疗后期的持久抗病毒作用。

慢性丙型肝炎干扰素疗效及影响因素

目的研究干扰素抗体（抗-IFN）对慢性丙型肝炎患者细胞免疫功能及干扰素（IFN）疗效影响．方法应用ELISA法观察接受干扰素治疗的40例患者的抗-IFN与临床疗效及T淋巴细胞工群的关系．结果抗-IFN水平与慢性丙型肝炎疗效呈负相关（r＝－0．3487，t＝2．2935，P＜0．05）．抗-IFN产生不仅使IFN疗效不稳固，复发率升高，而且影响IFN对细胞免疫功能的调节．结论抗-IFN和T淋巴细胞亚群是影响慢性丙型肝炎IFN疗效的重要因素之一，其检测有助于估计及预测干扰素的疗效．

丙型肝炎病毒在辅助生殖技术中的存在与垂直传播

垂直传播是儿童感染丙型肝炎病毒（HCV）的主要方式，近年来受到广泛关注。随着辅助生殖技术的发展，越来越多的HCV感染不孕夫妇寻求辅助生殖技术治疗以获得后代。辅助生殖技术过程中HCV的垂直传播现象仍不可避免，了解HCV在母体和胚胎内的存在与风险，有利于在解决生育问题的同时更好地控制HCV的垂直传播，预防儿童感染。

丙型肝炎患者血清自身抗体检测的相关分析

目的了解慢性丙型肝炎患者血清中自身抗体阳性率,探讨自身免疫在丙型肝炎病毒(HCV)感染中的意义。方法选取2014年1月至2015年3月该院收治的丙型肝炎患者127例作为丙型肝炎组,另选取同期该院体检中心健康体检者30例作为对照组。采用间接免疫荧光法(IIF)检测两组受检者血清中抗核抗体(ANA),免疫印迹法检测抗线粒体抗体(AMA)、抗可提取性核抗原(ENA)抗体、抗肝抗原抗体谱,采用实时荧光定量PCR法检测血清HCVRNA含量。结果丙型肝炎组有61例检测出1项或1项以上自身抗体阳性,自身抗体阳性率为48.03%(61/127),高于对照组的3.33%(1/30),差异有统计学意义(P<0.01)。丙型肝炎组HCV-RNA阳性46例,其中自身抗体阳性29例(63.04%),HCV-RNA阴性81例,自身抗体阳性32例(39.51%),两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HCV感染机体可诱发自身免疫反应,产生多种自身抗体,尤其以HCV-RNA阳性患者更为明显,HCV感染者有必要进行血清自身抗体检测,从而指导临床医生对患者实施个体化治疗。

慢性乙型肝炎临床免疫学研究进展

近年来，临床免疫学在慢性乙型肝炎研究领域中的应用价值日益凸显。一方面，天然免疫识别机制、新型免疫细胞亚群以及免疫调节通路的发现与鉴定进一步丰富了慢性乙型肝炎的免疫学发病机理。另一方面，Toll样受体激动剂、免疫细胞及治疗性疫苗等旨在重建机体抗病毒免疫的新型免疫治疗手段的研发，为慢性乙型肝炎抗病毒治疗策略的优化提供了新的靶点，也为促进患者的HBsAg阴转及临床治愈带来了新的契机。

慢性病毒性肝炎患者肝组织免疫组织化学研究

目的 探讨病毒性肝炎肝纤维化的发生机制,对115例慢性病毒性肝炎的肝穿刺标本进行免疫组织化学研究.方法 采用免疫组织化学(IHC)染色,在完全相同的实验条件下检测99例慢性乙型肝炎、16例肝硬化的Ⅳ型胶原Ⅳ-C;α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);基质金属蛋白酶-2(MMP-2);金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)的表达状况.结果Ⅳ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白在重度肝炎及肝硬化组织中的表达明显高于轻度(A)及中度(B)慢性肝炎(P<0.01);轻、中度两组的MMP-2/TIMP-2>1,而在重度(C)及肝硬化组,MMP-2/TIMP-2<1.结论 Ⅳ-C、α-SMA、MMP-2、TIMP-2在重度及肝硬化组两组中表达明显,而且在重度、肝硬化组中的表达与轻、中度组中的表达比较差异有统计学意义(P<0.05).同时,重度及肝硬化组,MMP-2与TIMP-2的比值失衡.