乙型肝炎病毒x抗原在HBV宫内感染中的作用机制

目的研究高复制水平HBV血清感染人绒毛膜滋养细胞株JEG-3后细胞内乙型肝炎病毒x抗原(HBxAg)及其下游蛋白在细胞内的表达情况,探讨HBxAg在HBV宫内感染中的作用。方法对人早孕绒毛膜滋养细胞株JEG-3进行传代培养,将高复制水平乙型肝炎病毒血清(HBV-DNA定量为107～108拷贝/mL)与传代培养的JEG-3细胞共同孵育48～72h;逆转录-聚合酶链式反应检测细胞内HBx-mRNA水平;Western blot检测细胞内HBxAg的表达;免疫组化检测细胞内HBxAg表达以及细胞内磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)的表达;流式细胞仪检测细胞内pAKT的表达。结果 HBV感染JEG-3细胞后,在细胞中检测到HBx-mRNA,并检测到HBxAg的表达,同时发现细胞内PI3K及pAKT的表达水平明显增加,经统计学分析,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HBxAg/PI3K/pAKT抗细胞凋亡途径是高复制水平HBV宫内感染的可能机制。

乙型肝炎病毒X抗原与肝癌的研究现状

乙型肝炎病毒X抗原 (HBxAg)是乙型肝炎病毒 (HBV)X基因区编码的多肽 ,在肝癌组织细胞中呈高表达状态。HBxAg反式激活肝细胞原癌基因异常活化 ,促使肝细胞发生癌变。HBxAg与抑癌基因p53形成复合物 ,使p53基因失活并参与肝癌的发生。抗 HBx抗体可用于肝癌导向治疗 ,针对HBx的核酶可望用于肝癌的基因治疗。

乙型肝炎病毒X抗原转导细胞差示表达全长基因C2的克隆及初步功能研究

目的 克隆乙型肝炎病毒X抗原 (HBxAg)相关肝癌差示表达基因并做功能研究。方法 (1)用逆转录病毒方法建立表达HBxAg细胞模型。 (2 )用抑制差减杂交做基因差示表达分析。 (3)做RNA印迹分析 (NorthernBlot)及原位分子杂交筛选基因探针。 (4 )用 5′和 3′迅速末端扩增法 (RACEPCR)进行全长基因序列扩增 ,并进行体外蛋白翻译及制备抗体 ,做蛋白质印迹 (WesternBlot)分析。(5 )进行该基因细胞内转导 ,进行功能研究。结果 共得到 10个cDNA探针 ,其中 8个因HBX表达上调 ,2个表达下降。经筛选及全长基因扩增 ,得到 1个全长为 1.35kb、编码 113个氨基酸的全长基因C2 ,和蛋白翻译起始因子 (Suil)同源 ,其表达被HBX抑制。初步功能研究显示 ,此基因对细胞生长具有抑制作用 ,并且正常肝组织中其mRNA信号明显高于肝癌组织。结论 我们不仅克隆出HBX相关基因C2并进行了功能研究 ,还首次提出DNA病毒 (HBV)

乙型肝炎病毒X抗原结合蛋白1的原核表达及亚细胞定位

目的应用酵母双杂交及生物信息学技术筛选乙型肝炎病毒X抗原结合蛋白1(HBXBP1)并进行克隆,探讨其在大肠埃希菌BL21中表达及亚细胞定位。方法应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBXBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,通过IPTG诱导表达以获得HBXBP1融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析证实融合蛋白的特异性;构建HBXBP1基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-HBXBP1,转染HepG2细胞,24h后于荧光显微镜下观察表达蛋白的亚细胞定位。结果 RT-PCR扩增获得921bp的HBXBP1基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导成功获得约56kD的重组蛋白,经Western blot分析证实其具有良好的特异性;成功构建HBXBP1基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-HBXBP1,其表达蛋白定位于细胞质。结论 pET-32a(+)-HBXBP1原核表达载体在大肠埃希菌BL21中诱导表达HBXBP1融合蛋白;HBXBP1基因可表达HBXBP1蛋白且定位于细胞质,为研究HBXBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了一定的理论基础。

胎盘滋养细胞凋亡在HBV宫内感染中的作用研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)体外感染人绒膜滋养细胞株JEG.3后对细胞凋亡水平的影响,明确HBV感染胎盘的可能机制。方法用人HBVDNA^+血清体外感染JEG-3,免疫组化和Western Blot检测细胞内HBVX抗原(HBxAg)的表达;用Annexin-V荧光素探针标记细胞表面的PS磷脂酰丝氨酸,利用流式细胞仪检测早期细胞凋亡,碘化丙啶(PI)检测中晚期细胞凋亡。结果 HBV体外感染人绒癌细胞株JEG-3后,细胞内检测到HBxAg的表达;细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率明显降低。流式细胞仪Annexin V+PI双染方法检测细胞凋亡状态,HBV血清感染组细胞的早期凋亡水平和晚期凋亡水平均低于正常人血清对照组(t值分别为3.27、2.01,均P<0.05),差异均有统计学意义。结论 HBV体外感染人绒癌细胞株JEG-3可表达HBxAg,从而抑制了细胞的早期凋亡及晚期凋亡;其是HBV感染胎盘的可能机制。

合成多肽抗原检测原发性肝癌血清标志物ELISA方法的建立及应用

目的建立用合成多肽抗原检测原发性肝癌血清标志物的ELISA方法,并进行初步应用。方法利用筛选的5种与乙型肝炎病毒X抗原(HBx)诱导肝癌相关的细胞蛋白URG4、URG7、URG11、S15a和Sui1,作为原发性肝癌的筛查和早期诊断的血清标志物,根据上述蛋白的序列合成多肽(L4A/L4B、L7B、L11-1/L11-3/L11-4、L12A/L12B和Sui1A/Sui1B),作为检测抗原,建立检测相应抗体的间接ELISA法,并进行敏感性、特异性、精密性评价及临床应用。结果所建立的间接ELISA法敏感性为93.8%,特异性为97.9%,试验内和试验间变异系数分别为3.8%～5.6%和7.4%～10.3%;检测161份肝癌、肝硬化及乙型肝炎患者血清样本中,1种指标以上阳性检出率分别为90.4%、92.6%和61.7%,2种指标以上阳性检出率分别为78.6%、70.6%和48.3%;39份正常献血员血清中,1种指标以上阳性检出率为12.2%,2种指标以上阳性检出率为6.3%。结论所建立的ELISA法可作为目前的AFP和核磁共振诊断方法的有益补充,用于原发性肝癌高危人群的筛选和小肝癌的早期诊断。