三七总苷对肝癌细胞(QGY-7703)中mcl-1L和Bak基因表达水平的初步探索

目的:探讨三七总苷对肝癌细胞QGY-7703中mcl-1L基因与Bak基因表达水平的影响。方法:采用不同浓度三七总苷诱导肝癌细胞,通过实时荧光定量PCR检测mcl-1L基因与Bak基因的表达情况,同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡的改变。结果:三七总苷作用后,肝癌细胞mcl-1L基因的表达受到明显抑制,而Bak基因的表达则出现明显上调,mcl-1L/Bak呈上升趋势,细胞增殖受到抑制。结论:三七总苷可能通过影响mcl-1L/Bak表达水平影响细胞凋亡。

三种斑蝥素盐类物质对肝癌QGY-7703细胞生长的抑制作用

目的考察斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钠及斑蝥素酸钾,三种斑蝥素的盐类物质对肝癌QGY-7703细胞增殖的抑制作用。方法采用WST-1比色法测定三种斑蝥素盐类物质对肝癌QGY-7703细胞的生长抑制率。结果三种斑蝥素盐类物质对肝癌QGY-7703细胞的生长具有显著的抑制作用,抑制率随药物浓度升高其抑制作用增强,呈剂量效应关系。其半数抑制率IC50分别为9.48、33.80、35.04μmol/L。结论斑蝥素酸镁对肝癌QGY-7703细胞的抑制作用明显好于斑蝥素酸钠和斑蝥素酸钾,具有开发潜力。

红景天甙体外诱导人肝癌QGY-7703细胞凋亡研究

【目的】探讨红景天甙(Salidroside)体外诱导人肝癌QGY-7703细胞凋亡的作用及其可能的机制。【方法】以体外培养的人肝癌QGY-7703细胞作为研究对象,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测红景天甙对QGY-7703细胞生长的抑制作用,采用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光双染、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术,分析红景天甙对QGY-7703细胞凋亡的诱导作用;采用Western blot免疫印迹法探讨红景天甙诱导QGY-7703细胞凋亡的可能机制。【结果】MTT比色法试验结果表明,0.01,0.1,1,10和100μg/mL红景天甙对QGY-7703细胞生长均有不同程度的抑制作用,细胞生长抑制率分别为13.2%,21.9%,31.4%,46.8%和60.9%,半数抑制质量浓度(IC50)为18.56μg/mL;用10μg/mL红景天甙处理QGY-7703细胞48 h,AO/EB荧光双染后,可观察到个别QGY-7703细胞呈现亮绿色或橘红色,表明细胞发生了凋亡;琼脂糖凝胶电泳结果显示,10μg/mL红景天甙作用QGY-7703细胞24,48和72 h均可导致细胞核内DNA产生有序断裂,形成DNA梯形带;流式细胞术试验结果表明,10μg/mL红景天甙的加入量为100和200μL时,QGY-7703细胞凋亡数分别为178和331个,相应的凋亡率分别为1.8%和3.5%,阴性对照组(10μg/mL红景天甙加入量为0μL)凋亡细胞数为105个,凋亡率仅为1.1%;Western blot免疫印迹分析结果表明,红景天甙下调了Bcl-2和PCNA蛋白的表达量,而使凋亡活化基因Bax与肿瘤抑制基因p53的蛋白表达量增高。【结论】红景天甙对体外培养的QGY-7703细胞具有明显的生长抑制作用和诱导凋亡作用,其诱导凋亡作用与Bcl-2家族成员、p53、Bax和PCNA基因调控有关。

中药木回春对QGY—7703人肝癌细胞DNA合成的影响

目的 中药木回春全外抗肝癌作用研究。方法 采用^3H-TdR掺入法检测木回春对QGY-7703人肝癌细胞DNA合成的影响。结果 实验组QGY-7703细胞DNA合成量较对照组皆有明显减少。差异显著（P<0.001)。且DNA合成量随药物浓度增加呈减少趋势，ED50浓度为270.968ug/ml。结论 木回春可能成为治疗肝癌的理想药物。

人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术及二维电泳图谱的建立

目的:建立人肝癌细胞株QGY-7701蛋白质组学研究技术。方法:利用两种不同的裂解液提取细胞蛋白,进行双向电泳,经PDQuest软件分析与比较后,挑选匹配良好的10个蛋白点,进行基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的鉴定。结果:建立了稳定的人肝癌细胞株QGY-7701的双向电泳图谱,裂解液Ⅱ比裂解液Ⅰ提取的蛋白质量多25%,2-DE胶上蛋白点数多32%,从10个候选蛋向中鉴定出9个有意义的蛋白(P<0.05)。结论:初步建立了人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质组学研究技术,为进一步开展药物蛋白质组学研究奠定基础。

塞来昔布诱导人肝癌细胞株QGY-7701凋亡的研究

目的探讨塞来昔布体外诱导人肝癌细胞株QGY-7701凋亡的作用。方法设立空白对照组(培养液中不加任何药物)及塞来昔布5、25、50、100、150μmol.L-1 5个剂量组,作用时间分为24、48、72 h,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察塞来昔布不同浓度和作用时间对QGY-7701细胞生存率的影响,选择合适的作用时间和3个剂量再做其他凋亡方法的检测;采用Hoechst 33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化;采用双荧光染色(AnnexinV-EGFP/PI)流式细胞检测、末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)检测、DNA含量分析(检测细胞周期)等方法多指标检测细胞凋亡率。结果通过Hoechst 33258染色可以从细胞形态上看出塞来昔布诱导QGY-7701细胞凋亡,而Annexin V-EGFP/PI流式细胞检测、TUNEL检测、细胞周期及MTT检测结果显示随着塞来昔布浓度升高和作用时间延长,凋亡率升高(P<0.05,P<0.01)。结论塞来昔布有诱导肝癌细胞QGY-7701凋亡,抑制其生长的作用,具有治疗肝癌的潜在功能。

生长激素受体在Bel-7402与QGY-7701人肝癌细胞株中的表达

目的了解Bel-7402与QGY-7701人肝癌细胞株生长激素受体(GHR)的表达情况,以获得肝癌GHR在细胞水平上的定量表达。方法分别采用放射性配体分析与RT鄄PCR法检测GHR在Bel鄄7402与QGY-7701肝癌细胞株的表达。结果7402肝癌细胞可表达GHRmRNA,在蛋白表达水平放射性配体法发现GHR在此肝癌细胞位点数量(Site,103/cell)为7.348±0.891,平衡解离常数为0.63±0.04583nmol/L;未发现7701肝癌细胞株表达GHR。结论7402肝癌细胞株表达GHR,可为将来研究rhGH与原发性肝癌的增殖关系奠定一些实验基础。

人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的优化人肝癌细胞株QGY-7701的蛋白质样品制备方法,建立其亚细胞蛋白质组双向电泳技术。方法分步提取人肝癌细胞株QGY-7701细胞质、细胞膜和细胞核蛋白,采用不同的方法除盐、浓缩样品,然后分别采用2种不同的水化上样缓冲液重悬样品,进行双向凝胶电泳。结果使用三氯乙酸/丙酮的除盐效果好,样品损失少;采用上样缓冲液(7mol/L尿素+2mol/L硫脲+4%CHAPS+40mmol/L Tris+65mmol/L DTT+2%两性电解质)有利于蛋白的溶解,获得更多的蛋白信息,检出的细胞质蛋白点数可达(995±53),细胞膜蛋白点数可达(1035±58),细胞核蛋白点数可达(893±45)。结论获得了清晰的人肝癌细胞株QGY-7701亚细胞蛋白质组双向电泳图谱。

QGY-7701肝癌细胞株中癌-睾丸抗原GAGE-1基因的表达

目的研究癌-睾丸抗原GAGE-1基因mRNA在QGY-7701肝癌细胞株中的表达情况。方法运用反转录聚合酶链反应技术检测肝癌细胞株QGY-7701中GAGE-1基因mRNA的表达,并与正常肝组织比较。结果肝癌细胞株QGY-7701中GAGE-1基因呈阳性表达,正常肝组织中GAGE-1基因呈阴性表达。结论 GAGE-1基因具有作为诊断肝癌的分子标记和免疫治疗肝癌的特异性靶位的潜在价值。

呫吨酮并吡啶衍生物XP-15联合紫杉醇对耐药肝癌细胞QGY-7701的体外抑制作用

目的:探索呫吨酮并吡啶衍生物XP-15联合紫杉醇对人肝癌QGY-7701耐药细胞株的体外抗肿瘤作用。方法:运用CCK8法、Transwell实验和流式细胞仪检测凋亡技术观察细胞功能学变化,运用Western Blot蛋白免疫印迹技术探索其可能的作用机制。结果:XP-15可明显增强紫杉醇对耐药QGY-7701细胞的抑制作用,XP-15联合紫杉醇作用于耐药QGY-7701细胞24 h后,QGY-7701细胞活力明显减弱,且其侵袭迁移能力明显降低,同时流式细胞仪凋亡检测提示细胞凋亡百分比明显增加。Western Blot蛋白免疫印迹亦证实细胞抗凋亡蛋白bcl-2表达明显降低,肝癌增殖分化相关PI3K及AKT蛋白分子表达减少。结论:XP-15具有增敏紫杉醇诱导耐药QGY-7701细胞凋亡同时抑制其增殖活力的作用,其作用机制可能与下调PI3K-AKT通路活性,同时减少bcl-2抑制凋亡蛋白表达相关。

基因芯片技术分析斑蝥素对肝癌细胞细胞毒作用的分子机制

目的 :研究抗癌药斑蝥素对肝癌细胞细胞毒作用的分子机制。方法 :应用基因芯片技术检测 12 .5 μmol/ L 斑蝥素作用于肝癌 QGY770 3细胞 2 4 h后基因表达谱的变化。结果 :斑蝥素抑制细胞表达参与细胞周期进程基因 (如 p 2 7、ref - 1、DN Apolymerase delta、X RCC9等 )、能量代谢基因 (如 malate dehydrogenase、ADP/ ATP translocase等 )、致瘤活性基因 (如 c- myc、tre等 )以及肿瘤特异表达基因 (如 bladder cancer related protein等 )。相反 ,斑蝥素促进了多种细胞生长抑制基因 (如 BCRA2、BTG2、dual- specificity protein phosphatase等 )以及凋亡相关基因 (如 ATL - derived PMA- responsive peptide等 )的表达。 结论 :斑蝥素改变调控细胞周期进程、细胞增殖。

双向电泳分析肝癌细胞线粒体的差异表达蛋白

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,对线粒体蛋白质组的研究可能有助于解释癌症的发生、早期诊断以及抗癌药物的研发。本研究对正常肝细胞L02线粒体、表阿霉素干预前后肝癌细胞QGY-7703线粒体进行二维电泳图谱的比较分析,筛选差异表达蛋白斑点。方法:运用蔗糖密度梯度的超离心方法分离纯化线粒体,双向凝胶电泳分离线粒体蛋白质,ImageMaster2D软件对所得图谱进行图像分析。结果:L02细胞线粒体、表阿霉素干预前QGY-7703细胞线粒体、表阿霉素干预后QGY-7703细胞线粒体三种标本超离心后,其纯化线粒体琥珀酸脱氢酶比活力分别提高13.8、11.8、10.2倍。L02细胞线粒体和表阿霉素干预前后QGY-7703细胞线粒体经双向凝胶电泳分辨出206、217、214个蛋白斑点,L02细胞与QGY-7703细胞比较筛选出49个差异表达蛋白斑点;表阿霉素干预前后的QGY-7703细胞进行比较,筛选到29个差异表达蛋白斑点。结论:运用超离心和双向电泳的方法成功筛选出一批在QGY-7703细胞线粒体中差异表达的蛋白斑点。

半夏总生物碱对人肝癌细胞增殖的抑制作用研究

目的探讨半夏总生物碱(TATP)对人肝癌细胞株QJY-7703增殖的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及集落形成率实验,检测不同浓度的TATP对QJY-7703细胞株的生长抑制作用;应用单细胞凝胶电泳技术检测TATP导致QJY-7703细胞的DNA损伤情况。结果人肝癌细胞QJY-7703经TATP处理后,其体外增殖能力明显下降,且与药物的剂量、加药时间呈正相关,与对照组比较,差异均有统计学意义(24 h:对照组QJY-7703细胞增殖OD490=0.486±0.037,TATP组2.5、10.0、30.0、50.0 mg/L时的OD490分别为0.475±0.026、0.377±0.029、0.286±0.026、0.242±0.023;48 h:对照组OD490=0.793±0.046,TATP组2.5、10.0、30.0、50.0 mg/L时的OD490分别为0.747±0.028、0.497±0.025、0.287±0.021、0.207±0.020)(P<0.01或P<0.05)。单细胞凝胶电泳(SCGE)中,TATP组细胞尾DNA含量:对照组为(6.92±4.85)mg/L,TATP组10.0、40.0 mg/L时分别为(17.30±5.39)mg/L、(36.52±8.67)mg/L;尾长:对照组为(16.06±9.17)μm,TATP组10.0、40.0 mg/L时分别为(29.29±13.09)μm、(65.33±17.06)μm;尾动量:对照组为(0.97±0.34)μm,TATP组10.0、40.0mg/L时分别为(7.87±4.04)μm、(21.43±7.67)μm,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),且呈现浓度依赖性。结论在体外培养的条件下,一定剂量的TATP能明显抑制QJY-7703细胞增殖,其机制可能与DNA的损伤作用有关。

野生型RASSF1A基因抑制肝癌细胞增殖的分子机制

背景与目的:RASSF1A(ras association domain family1A)基因抑制肿瘤增殖的分子机制目前尚未完全明确,本文将探讨野生型RASSF1A基因抑制肝癌细胞增殖的分子机制。方法:利用已构建成功的稳定表达野生型和突变型RASSF1A基因的肝癌细胞株QGY-7703,使用流式细胞仪对其进行细胞周期的测定,Western blot分析其cyclin D1、cyclin E及P21蛋白的表达水平,通过检测荧光素酶报告基因活性及RT-PCR检测野生型RASSF1A基因的表达来分析RASSF1A基因对cyclin D1启动子和mRNA表达水平的影响。结果:野生型RASSF1A基因的表达可使QGY-7703细胞的细胞周期发生G1/S期阻滞,使其cyclin D1蛋白的表达水平下调,但不影响cyclinE和P21蛋白的表达水平。外源性cyclin D1的表达可使野生型RASSF1A基因引起的QGY-7703细胞G1/S期阻滞消失。野生型RASSF1A基因表达不影响QGY-7703细胞cyclin D1启动子的活性和cyclin D1 mRNA的表达水平。结论:野生型RASSF1A基因通过转录后机制负性调控cyclin D1蛋白的表达,使肝癌细胞株QGY-7703细胞周期阻滞在G1/S期。

布洛芬调控IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路对肝癌细胞株增殖及凋亡的影响

目的探讨布洛芬调控IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法选择人肝癌QGY-7703细胞为研究对象,采用随机数字表法将QGY-7703细胞随机分为对照组(Qc组)和不同浓度布洛芬组,每组6例:Q_1组(布洛芬作用浓度为250μmol/L)、Q_2组(布洛芬作用浓度为500μmol/L)、Q_3组(布洛芬作用浓度为1 000μmol/L)、Qc组加入等容量的RPMI-l640培养基。各组分别孵育24 h、48 h和72 h时,采用CCK-8法测定不同浓度及不同孵育时间细胞的增殖抑制情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况;孵育48 h时,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞中IKKβ和Bcl-2基因mRNA和蛋白的变化以及磷酸化IKKβ(p-IKKβ)、磷酸化IκBα(p-IκBα)、NF-κBp65蛋白的表达情况。结果与Qc组比较,Q_1组、Q_2组、Q_3组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均增加,差异有统计学意义(P<0.05);Q_1组、Q_2组、Q_3组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率依照布洛芬作用浓度和时间的增加而依次增加,具有浓度和时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);与Qc组比较,Q_1组、Q_2组、Q_3组细胞IKKβm RNA和Bcl-2 m RNA表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05);Q_1组、Q_2组、Q_3组比较,细胞IKKβm RNA和Bcl-2 m RNA表达依照布洛芬作用浓度的增加而依次下调,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);与Qc组比较,Q_1组、Q_2组、Q_3组细胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05);Q1组、Q2组、Q3组比较,细胞中IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表达依照布洛芬作用浓度的增加而依次降低,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。结论布洛芬可以抑制人肝癌QGY-7703细胞的增殖,促进细胞凋亡,可能与布洛芬调控细胞IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路有关。

人肝癌细胞移植瘤QGY-9204中细胞调亡和坏死并存现象的初步分析

关于细胞调亡和坏死的判别标准及其相互关系已逐渐成为研讨的热点．研究表明，p53基因的表达导致细胞周亡，抑制肿瘤形成．在将Ad／p53导人人肝癌细胞移植瘤QGY－9204的研究中发现，实验组与对照组的移植瘤中均出现凋亡特征指标（DNA梯型条带、凋亡小体等）．而离体培养的肝癌细胞QGY－7703并未检出细胞凋亡现象．那么，实体瘤的DNA梯型条带与调亡和坏死有何关系？研究表明，瘤体内细胞阔亡和坏死并存，与对照组相比，实验组的瘤体积较小，坏死面积小，凋亡比例较高．对移植瘤QGY－9204中细胞调亡和坏死的特征及其并存现象的可能原因进行了初步分析，推断：在该移植瘤内，凋亡和坏死并非是细胞死亡的两种相互排斥的选择，它们可能相继发生和互为影响．

稳定表达RFX6基因肝癌细胞株的建立

目的:建立稳定表达RFX6基因的肝癌细胞株。方法:构建人源RFX6基因的重组质粒(pLNCX2-RFX6),pVSV-G质粒分别与pLNCX2-RFX6和空载体pLNCX2共转染至GP2-293细胞中进行包装,并用包装的逆转录病毒感染人肝癌QGY-7703细胞株,G418筛选出阳性克隆。RT-PCR和蛋白质印迹法验证稳定细胞株RFX6基因表达情况。采用Image J软件进行灰度值分析比较两株细胞系的差异。结果:在QGY-7703-pLNCX2-RFX6和QGY-7703-pLNCX2细胞中,RFX6/18SmRNA电泳条带灰度比值分别为5.044 0±1.384 0和0.357 2±0.407 9,QGY-7703-pLNCX2-RFX6细胞RFX6/18S是QGY-7703-pLNCX2细胞的14.1倍,差异有统计学意义,t=4.143,P<0.05;而在两细胞株中,RFX6/GAPDH的蛋白质印迹条带灰度值分别为1.391 4±0.141 3和0.127 8±0.037 3,QGY-7703-pLNCX2-RFX6细胞RFX6/GAPDH是QGY-7703-pLNCX2细胞的10.9倍,差异有统计学意义,t=14.966,P<0.05。结论:成功构建稳定表达RFX6基因的肝癌细胞株,为研究RFX6基因在肝癌细胞中的功能奠定了基础。