舒芬太尼抑制肝癌Hep3B细胞活性及促进凋亡作用

目的探讨舒芬太尼对肝癌Hep3B细胞活性的影响及相关机制。方法以Hep3B肝癌细胞为研究对象,经不同浓度(0.01、0.1、1、5、10、15μmol/L)舒芬太尼处理后,MTT法观察细胞活性的改变,流式细胞仪及AnnexinV/PI双标记染色检测Hep3B细胞周期及凋亡的变化,Western blot检测survivin及caspase-3蛋白的表达。结果随着舒芬太尼浓度的增加,肝癌细胞活性降低,细胞周期停滞在G0/G1期,细胞凋亡增多,survivin蛋白表达量降低,caspase-3蛋白表达量升高。结论舒芬太尼能通过改变肝癌细胞的细胞周期,促进细胞凋亡,改变survivin和caspase-3蛋白的表达,抑制Hep3B细胞的活性。

汉防己碱对肝癌Hep3b细胞生长的双向作用

目的考察汉防己碱(tetrandrine,Tet)对肝癌Hep3b和Hep3b/5-Fu细胞生长的影响。方法采用体外细胞培养,结合流式细胞术、MTT和Western blot方法研究Tet(0.33～1.0μg/ml)对肝癌Hep3b及Hep3b/5-Fu细胞生长的作用特点。结果 Tet在0.33～1.0μg/ml时呈浓度依赖性降低Hep3b细胞存活率;0.5和1.0μg/ml显著提高5-Fu对Hep3b细胞的IC50,但降低5-Fu对Hep3b/5-Fu细胞的IC50;0.33μg/ml的Tet明显增加cDDP对Hep3b/5-Fu细胞的IC50,而0.5和1.0μg/ml显著降低cDDP对Hep3b/5-Fu细胞的IC50(P<0.01)。1.0μg/ml的Tet作用48 h后使Hep3b细胞中的P-gp和MRP1表达明显上调(P<0.05)。Tet单用对Hep3b细胞生长有一定抑制作用,高浓度Tet逆转Hep3b/5-Fu细胞对5-Fu耐药和增强cDDP对Hep3b/5-Fu细胞生长的抑制作用,但低浓度分别促进Hep3b细胞和Hep3b/5-FU细胞对5-Fu和cDDP耐药。结论 Tet对Hep3b和Hep3b/5-Fu细胞生长呈浓度相关的双向作用,其促进耐药细胞发展的机制至少与提升P-gp和MRP1表达有关。

大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制

目的了解大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制。方法采用MTT法测定不同浓度大黄素对人肝癌Hep3b细胞的抑制作用,不加大黄素作为对照组;采用流式细胞仪检测大黄素作用后的Hep3b细胞的增殖周期,计算细胞增殖指数(PI);Western印迹法检测Hep3b细胞凋亡相关蛋白AKT、Bcl-2、p-AKT和酶切caspase-3的相对表达量。结果 1、5、25、125μmol/L大黄素作用24 h后的OD值均低于对照组(t=1.694、6.129、13.400、34.739,P均<0.05);随着大黄素浓度的升高,它对Hep3b细胞的抑制率呈上升趋势;作用24 h时,大黄素对Hep3b细胞的半抑制浓度(IC50)为21.08μmol/L。25、125μmol/L大黄素作用24、36 h后,Hep3b细胞的G_0/G_1期比例增高(P<0.05),S期比例、PI降低(P<0.05),因而表现出浓度、时间依赖性。大黄素作用时间增加后,抑制细胞凋亡的Bcl-2(24 h:t=2.610;36 h:t=5.713)、p-AKT蛋白(12 h:t=2.075,24 h:t=5.157;36 h:t=12.926)的表达量呈下降趋势(P均<0.05),促进细胞凋亡的酶切caspase-3蛋白的表达量呈上升趋势(6、12、24、36 h:t=2.487、3.327、5.276、8.137,P均<0.05)。结论大黄素在体外通过诱导细胞凋亡而抑制人肝癌Hep3b细胞的增殖,大黄素是通过AKT信号途径诱导Hep3b细胞凋亡。

葡萄籽提取物原花青素通过LncRNA NBR2/miR-650调节EMT抑制肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的分子机制

目的探讨葡萄籽提取物原花青素是否通过长链非编码RNA(LncRNA)NBR2/微小RNA(miR)-650并调节上皮间充质转化(EMT)来影响肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移和侵袭。方法将肝癌细胞Hep3B分为NC组(未处理),低、中、高剂量组(给予25、50、100μg/ml葡萄籽提取物原花青素),si-NC组,si-LncRNA NBR2组,si-NC+高剂量组、si-LncRNA NBR2+高剂量组,anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高剂量组。采用Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、EMT过程E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白表达,细胞计数试剂盒(CCK)-8、Transwell法和定量RT-PCR(qRT-PCR)分析细胞增殖、迁移、侵袭与LncRNA NBR2、miR-650的表达。双荧光素酶活性检测LncRNA NBR2和miR-650的靶向结合。结果低、中、高剂量组葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌细胞Hep3B CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达量、增殖能力、迁移数量、侵袭数量、miR-650表达量均低于NC组,LncRNA NBR2表达量高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌细胞Hep3B细胞中E-Cadherin蛋白表达量高于NC组,N-Cadherin、Vimentin蛋白表达量低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。si-LncRNA NBR2组的肝癌细胞Hep3B细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达量、增殖能力、迁移和侵袭数量均比si-NC组高,差异有统计学意义(P<0.05)。si-LncRNA NBR2+高剂量组肝癌细胞Hep3B细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9、N-Cadherin、Vimentin蛋白表达量、增殖能力、迁移和侵袭数量均高于si-NC+高剂量组,E-Cadherin蛋白表达量低于si-NC+高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。LncRNA NBR2靶向调控miR-650的表达。anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高剂量组肝癌细胞Hep3B CyclinD1、MMP2、MMP9、N-Cadherin、Vimentin蛋白、LncRNA NBR2表达量及增殖能力、迁移和侵袭数量均低于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,E-Cadherin蛋白表达量高于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论葡萄籽提取物原花青素通过上调LncRNANBR2靶向下调miR-650并调节EMT,来抑制肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移和侵袭。

复方苦参注射液对肝癌Hep3B细胞增殖影响

目的探讨复方苦参注射液对肝癌Hep3B细胞增殖的影响。方法运用细胞计数法(CCK-8)检测复方苦参注射液对肝癌Hep3B细胞的抑制作用。采用流式细胞术检测复方苦参注射液对肝癌Hep3B细胞周期的及凋亡的影响。结果复方苦参注射液对Hep3B细胞的增殖有明显的抑制作用,且存在时间-浓度依赖性。随着复方苦参注射液浓度的增加,凋亡细胞的比例逐渐增大,G1期细胞逐渐增加,S期细胞逐渐减少。结论复方苦参注射液可以抑制Hep3B细胞的生长,可能与促进细胞凋亡并引起细胞阻滞有关。

齐墩果酸对肝癌细胞Hep3B增殖和凋亡的作用研究

目的研究齐墩果酸对人肝癌细胞株Hep3B增殖和凋亡的影响及其与细胞内钙离子浓度{[Ca2+]i}关系。方法将浓度分别为40、80、100μg/ml齐墩果酸作用于肝癌Hep3B细胞24 h以后,DAPI染色,荧光显微镜观察对照组和处理组细胞形态变化;以11组不同浓度齐墩果酸(5～400μg/ml)作用Hep3B细胞24 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Hep3B细胞增殖情况;分别以不同浓度齐墩果酸(80、100、150μg/ml)作用Hep3B细胞24 h后,流式细胞仪检测细胞周期变化、细胞凋亡率、细胞内钙离子浓度;对钙离子荧光强度与细胞凋亡率进行相关性分析。结果各处理组Hep3B细胞出现凋亡;不同浓度齐墩果酸能够抑制肝癌细胞Hep3B增殖,且在5～100μg/ml范围内呈剂量依赖性,药物作用细胞24、48 h的IC50分别为86.04、93.29μg/ml;各处理组细胞周期在G2/M期产生阻滞、[Ca2+]i较对照组显著增加(P<0.05),细胞凋亡率和[Ca2+]i增加与药物浓度呈依赖关系;钙离子荧光强度与细胞凋亡率之间存在线形相关性(P<0.05)。结论齐墩果酸能够抑制肝癌Hep3B细胞株增殖,可能通过上调[Ca2+]i诱导其凋亡。

类泛素FAT10高表达肝癌细胞株Hep3B酵母双杂交cDNA文库的构建

目的:构建类泛素FAT10高表达肝癌细胞株Hep3B的酵母双杂交用cDNA文库.方法:从肝癌细胞Hep3B中提取总RNA,分离mRNA.利用反转录酶M-MLV与Oligo(dT)AnchorPrimer合成1stStrandcDNA,用E.coliDNAPolymerase与E.coliDNALigase将RNA链置换成DNA链,合成2ndStrandcDNA.将双链cDNA与EcoRⅠAdaptor连接,然后用EcoRⅠ/XhoⅠ进行酶切.使用SpinColumn除去短链cDNA与pGADT7载体连接,转化入E.coliDH10B,建成原始文库.然后对其进行扩增并随机挑取单菌落,酶切鉴定重组子插入片段大小.结果:提取的总RNA降解少且分子完整;RNA纯度高,相对分子质量为400-5000bp;成功合成双链cDNA,均符合建库要求;库容量达到1.03×106克隆,原始文库滴度为2.50×109cfu/L,扩增后的文库滴度为3.60×1012cfu/L.插入片段大小分布为0.5-3.5kb,平均长度约为2.0kb.结论:所构建文库的各项指标均达到要求,为筛选FAT10作用蛋白奠定了重要基础.

白藜芦醇对低分化肝癌细胞Hep3B增殖凋亡的影响

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)对低分化肝癌细胞Hep3B增殖凋亡的影响。方法:分别用不同浓度的Res(0、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)处理Hep3B细胞,利用CCK-8法、PI染色、Annexin V-FITC/PI染色实验分别检测不同浓度的Res对低分化肝癌细胞Hep3B增殖、周期、凋亡的影响。结果:不同浓度的Res处理低分化肝癌细胞Hep3B后,Hep3B细胞的增殖能力下降,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.01);低分化肝癌细胞Hep3B细胞周期被阻滞在G2/M期,而细胞凋亡率显著增强(P<0.05)。结论:Res可抑制低分化肝癌细胞Hep3B的增殖并促进其凋亡,对细胞周期具有阻滞效应,为肝癌的临床治疗提供了新思路与新方向。

NVP-BEZ235诱导自噬在肝癌细胞凋亡中的作用研究

目的以Hep3B和PLC/PRF/5两种肝癌细胞为研究对象,探讨自噬在NVP-BEZ235中引起细胞凋亡的作用.方法人类肝癌细胞Hep3B和PLC/PRF/5在含有10%FBS的DMEM培养基中进行培养,然后再进行细胞活性检测,用于Western blotting检测及线粒体膜电位(MMP)分析.结果 NVP-BEZ235能够有效增加LC3-Ⅱ的表达,并同时降低p62的表达,由此推断,NVP-BEZ235也能够诱导产生自噬,与Atg5的siRNA或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合应用时,肝癌细胞的生长被抑制.结论 NVP-BEZ235与Atg5的siRNA或者3-MA的联合应用能够促进细胞凋亡,NVP-BEZ235和自噬抑制剂的联合应用可为肝癌和其他恶性肿瘤临床治疗提供新的方法.

腺病毒介导的BIRC5-shRNA增强索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的研究BIRC5靶向基因治疗联合索拉非尼分子靶向治疗肝癌的协同效应以及对肝癌细胞凋亡的诱导作用。方法构建BIRC5特异性小发卡RNA的腺病毒AdEGFP-shBIRC5,用免疫细胞化学染色法检测其对BIRC5的沉默作用。建立肝癌移植瘤模型验证AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼治疗的疗效,采用免疫组化染色法鉴定AdEGFP-shBIRC5对癌细胞BIRC5基因表达的抑制作用;TUNEL法标记AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡。结果腺病毒介导的BIRC5-shRNA表达能有效沉默肝癌细胞BIRC5表达,AdEGFP-shCtrl对照组的BIRC5阳性表达率为(78.8±12.6)%,AdEG-FP-shBIRC5实验组为(20.6±8.2)%,两组差异有统计学意义(P<0.01)。Hep3B裸鼠移植瘤治疗后5周,与空白对照组相比,AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼组、单用AdEGFP-shBIRC5组、单用索拉非尼组的抑瘤率分别为61.78%(P=0.0032)、42.36%(P=0.0059)和29.20%(P=0.0169);与此对应,AdEGFP-shBIRC5联合索拉非尼组与单用索拉非尼组相比,肝癌细胞BIRC5表达被抑制(P=0.0364),细胞凋亡比例明显升高(P=0.0296)。结论针对BIRC5的基因治疗能提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性,显著诱导癌细胞凋亡。

通道抑制剂NVP与3-MA联合应用对肝癌细胞凋亡的影响

目的以人类Hep3B和PLC-PRF-5两种肝癌细胞为研究对象,探讨自噬在NVP-BEZ235引起的细胞凋亡中的作用.方法人肝癌细胞Hep3B和PLC-PRF-5在培养基中培养,行细胞活性检测实验,洗涤后应用流式细胞仪对JC-1阳性细胞进行检测,并行线粒体膜电位(MMP)分析.结果 NVP-BEZ235能够有效增加LC3-Ⅱ的表达,并同时降低p62的表达,当NVP-BEZ235与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合应用时,肝癌细胞的生长明显被抑制.结论 NVP-BEZ235与3-MA联合应用能够促进细胞凋亡,为肝癌和其他恶性肿瘤的临床治疗提供参考.

海藻玉壶汤对Hep3B肝癌裸鼠肝功能及CyclinD1、Bax蛋白表达的影响

目的:观察海藻玉壶汤对人肝癌移植瘤裸鼠的抗癌作用,以及对肝功能指标血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartic transaminase,AST)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞凋亡调控基Bax蛋白表达的影响。方法:30只BALB/c裸鼠皮下接种Hep3B细胞,建立肝癌异位移植瘤模型,分为模型组(9 g·L-1氯化钠溶液灌胃),阳性对照组(盐酸多柔比星腹腔注射),海藻玉壶汤高剂量组、中剂量组、低剂量组(海藻玉壶汤灌胃)。治疗21 d后,称量小鼠体质量,取肿瘤组织测瘤质量、常规HE染色;免疫组织化学检测肿瘤组织CyclinD1、Bax;生化分析仪检测血清ALT、AST。结果:各组小鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。海藻玉壶汤高剂量组、中剂量组、低剂量组与模型组比较,移植瘤瘤质量较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色观察肿瘤组织病理学可见治疗组不同程度肿瘤细胞灶性坏死,胞核固缩深染。免疫组织化学可见海藻玉壶汤各组CyclinD1蛋白阳性表达下降(P<0.05),Bax蛋白阳性表达增强(P<0.05)。结论:海藻玉壶汤可剂量依赖性地抑制裸鼠Hep3B移植瘤生长,一定程度上保护肝功能,并通过影响细胞周期和凋亡发挥抗肿瘤作用。

NVP-BEZ235与3-甲基腺嘌呤联合应用对肝癌细胞凋亡效果的研究

目的以人类Hep3B和PLC-PRF-5两种肝癌细胞为研究对象,探索自噬在NVP-BEZ235引起的细胞凋亡中所起到的作用。方法人肝癌细胞Hep3B和PLC-PRF-5在培养基中培养,进行细胞活性检测实验,洗涤后应用流式细胞仪对JC-1阳性的细胞进行检测,进行线粒体膜电位(MMP)分析。结果 NVP-BEZ235也能够有效的增加LC3-II的表达并同时降低p62的表达,当NVP-BEZ235与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合应用时,肝癌细胞的生长明显被抑制。结论研究发现,NVP-BEZ235与3-MA的联合应用能够促进细胞的凋亡,进而提出这样一种抗肿瘤作用的治疗方法——敲除自噬,为肝癌和其他恶性肿瘤的临床治疗提出了一项新的进步性的方法。