circUBAP2靶向miR-2467-3p对肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的影响

目的:探索circUBAP2靶向miR-2467-3p对肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的影响。方法:qRT-PCR测定43例肝癌组织中circUBAP2和miR-2467-3p表达。在肝癌Huh-7细胞中转染si-NC(si-NC组)、si-circUBAP2(si-circUBAP2组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-2467-3p模拟物(miR-2467-3p组),或共转染si-circUBAP2+anti-miR-NC(si-circUBAP2+anti-miR-NC组)、si-circUBAP2+anti-2467-3p(si-circUBAP2+anti-2467-3p组),CCK-8和平板克隆实验测定细胞活性与克隆形成,Western blot测定cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡。双荧光素酶报告实验确定circUBAP2与miR-2467-3p的靶向关系。结果:43例肝癌组织中circUBAP2表达比癌旁组织升高,miR-2467-3p表达比癌旁组织减少(P<0.05)。circUBAP2和miR-2467-3p表达与肝癌患者病理级别、FIGO分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。干扰circUBAP2表达,Huh-7细胞活性和克隆形成数降低,cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达和凋亡率升高(P<0.05)。circUBAP2靶向调控miR-2467-3p表达。miR-2467-3p过表达提高肝癌Huh-7细胞cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达和凋亡率,降低细胞活性和克隆形成数(P<0.05)。下调miR-2467-3p表达逆转了干扰circUBAP2表达对肝癌Huh-7细胞增殖和凋亡的作用。结论:干扰circUBAP2表达通过靶向miR-2467-3p促进肝癌Huh-7细胞凋亡并抑制其增殖。

健脾益气方对炎症微环境下人肝癌Huh-7细胞的增殖、侵袭及凋亡作用研究

目的探究健脾益气方对脂多糖(LPS)联合三磷酸腺苷(ATP)刺激下的构造的炎症微环境下人肝癌Huh-7细胞的增殖、侵袭及凋亡作用影响,并检测细胞中白细胞介素(IL)-1β、IL^(-1)8的表达水平。方法构建健脾益气方含药血清,采用向细胞培养基中加入LPS与ATP共培养的方法刺激肝癌细胞并构建炎症微环境。将细胞分为空白组、模型组、VX-765组(10μmol·L^(-1))、低浓度中药组(15%健脾益气方低剂量含药血清)、中浓度中药组(15%健脾益气方中剂量含药血清)、高浓度中药组(15%健脾益气方高浓度含药血清)。细胞干预后采用CCK-8法检测各组细胞的增殖水平;通过Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞的凋亡率;采用Transwell法检测各组细胞侵袭水平;采用PI单染色法检测各组细胞的周期水平;采用ELISA法、Western blot法检测Huh-7细胞中IL^(-1)b及1L^(-1)8表达水平。结果与空白组相比,采用LPS与ATP刺激后的模型组Huh-7细胞的增殖水平、侵袭水平与IL^(-1)β及1L^(-1)8表达水平更高(P<0.05),凋亡水平更低(P<0.05)。与其他组别相比,中浓度中药组与高浓度中药组能有效抑制Huh-7细胞的增殖水平与侵袭水平,阻滞细胞增殖周期,降低细胞存活率(P<0.05),并能显著诱导Huh-7细胞凋亡(P<0.05),并且降低Huh-7细胞中IL^(-1)β及1L^(-1)8表达水平(P<0.05)。结论中浓度及高浓度的健脾益气方含药血清能够通过改善肝癌Huh-7细胞中的炎症微环境实现对人肝癌Huh-7细胞的抑制增殖与侵袭,阻滞细胞周期和诱导凋亡作用,其作用机制可能与抑制肝癌细胞分析炎症因子IL^(-1)β及1L^(-1)8水平以实现对原发性肝癌的治疗目的。

保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞的作用及机制研究

目的探讨保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用及机制,为临床应用与推广提供科学的理论及实验数据。方法体外培养人肝癌Huh-7细胞,实验分为四组:对照组(生理盐水)、保肝蒙药Ⅰ号组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组、保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组。分别采用MTT法、流式细胞术和Q-PCR技术观察药物干涉后对肝癌细胞增殖的抑制作用,对肝癌细胞凋亡、细胞周期阻滞和相关基因表达的影响。结果 5-Fu组、保肝蒙药Ⅰ号(4 mg/m L)组和保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组对Huh-7肝癌细胞增殖抑制率分别达到67.70%、73.67%和75.35%。保肝蒙药Ⅰ号组单独作用于Huh-7肝癌细胞以及保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组联合作用,细胞的凋亡率均显示增加(P<0.05)。与对照组比较,保肝蒙药Ⅰ号组和5-Fu组分别作用于Huh-7肝癌细胞后显示细胞G_0/G_1期比率明显增加(P<0.05);然而,保肝蒙药Ⅰ号联合5-Fu组作用于Huh-7肝癌细胞后显示细胞S期比率明显增加(P<0.05)。保肝蒙药Ⅰ号组对凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达具有调控作用,能上调细胞色素C的表达。结论保肝蒙药Ⅰ号对人肝癌Huh-7细胞增殖有显著的抑制作用,其机制与细胞周期阻滞及影响肿瘤细胞凋亡相关基因的表达相关。研究成果将对阐明临床应用的保肝蒙药Ⅰ号治疗肝癌的机制及推广应用有重要意义。

抑制IGF2基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用

目的:研究抑制人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用。方法:将重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控抑制IGF2基因的siRNA表达载体pGL3-h AFP-hTERT-siRNA3(简称siRNA3)转染Huh-7细胞和正常肝L-02细胞,另设阴性对照(载体p GL3-hAFP-hTERT)组和空白对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞转染48 h后IGF2 mRNA表达;酶标仪检测转染0、24、48、72 h后的细胞活性;流式细胞仪检测转染48h后细胞周期、细胞凋亡;Western blot法检测细胞IGF2、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)E2、Cyclin D2、Cdc2、Bcl-2蛋白表达水平。结果:与阴性对照组和空白对照组比较,转染siRNA3的Huh-7细胞中IGF2 mRNA表达明显减弱,转染48、72 h后Huh-7细胞活性明显降低,G1期Huh-7细胞明显增加,S期Huh-7细胞明显减少;Huh-7细胞早期、晚期及总凋亡百分比均明显增加,IGF2、PCNA、Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2和Bcl-2蛋白表达均明显减弱,以上差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。转染siRNA3表达载体的L-02细胞上述指标均无明显变化(P>0.05)。结论:重组hAFP和hTERT双启动子调控针对IGF2基因的siRNA可特异性抑制Huh-7细胞IGF2表达及细胞增殖,其可能与下调IGF2 mRNA及蛋白表达,进而引起细胞增殖相关基因PCNA、细胞周期调控相关基因Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2及细胞凋亡调控相关基因Bcl-2蛋白表达下调有关。

沉默GPC3对肝癌Huh-7细胞增生、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨Hippo通路靶向GPC3后对肝癌Huh-7细胞增生、迁移、侵袭能力的影响。方法采用Western blot检测法及RT-PCR分别测量肝癌Huh-7不同对数生长期的肝癌细胞株GPC3蛋白表达水平及GPC3 mRNA水平,并筛选出可有效沉默GPC3基因的siRNA。将肝癌Huh-7细胞株分为实验组、未转染组及对照组,实验组导入GPC3-siRNA-1633转染Huh-7,其余两组不作处理。EdU实验检查三组细胞增殖率,划痕实验测定各组细胞迁移率,Transwell实验测定各组细胞侵袭能力。结果实验组GPC3 mRNA表达量及GPC3蛋白水平显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组Hippo通路中YAP mRNA表达量显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。转染48 h后,实验组细胞增生率、迁移率及侵袭率显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPC3可促进肝癌Huh-7细胞增殖、侵袭及转移,从而促进肝癌细胞生长。CPG3可通过上调Hippo通路中YAP表达水平从而促进肝癌细胞增生。通过沉默GPC3 mRNA后可有效抑制肝癌Huh-7细胞生长。

HSV-tk联合GCV自杀系统对肝癌细胞株Huh-7杀伤作用的研究

单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessi mplex virus-thymidine kinase,HSV-tk)基因,是目前研究比较多的自杀基因,其与前体药物丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)构成HSV-tk/GCV自杀基因系统。本实验将携带HSV-tk基因的慢病毒转染Huh-7细胞,通过报告基因反映慢病毒的转染效率;基因组PCR及RT-PCR检测转染Huh-7细胞中的HSV-tk基因的整合及表达;MTT检测不同浓度药物处理后的细胞存活率;最后HSV-tk+与HSV-tk-的Huh-7细胞以不同比例混合,MTT测定GCV作用后细胞的存活率。结果表明,HSV-tk/GCV系统作用于Huh-7细胞后,细胞出现明显的凋亡现象,旁观者效应比较明显。

α-番茄碱对人肝癌细胞HuH-7增殖、迁移及糖酵解活性的影响

目的 研究α-番茄碱对人肝癌细胞HuH-7增殖、凋亡、迁移及相关蛋白的影响。方法 不同浓度α-番茄碱(1、1.5、2、2.5μmol/L)处理肝癌细胞24 h,检测HuH-7细胞糖酵生化指标变化,细胞增殖实验和平板克隆实验检测细胞增殖活性变化,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移活性变化,Western blot检测糖酵解相关蛋白HIF-1α、MCT4、LDHA表达,生物信息分析MCT4的基本情况。结果 与对照组比较,α-番茄碱处理后HuH-7细胞葡萄糖消耗水平、乳酸生成水平、ATP水平、细胞增殖能力、转移能力、HIF-1α、MCT4和LDHA蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),且生信分析表明MCT4在肝癌细胞中高表达并且与不良预后有密切关系。结论 番茄碱可能通过抑制糖酵解降低人肝癌细胞HuH-7增殖与迁移能力,且可能抑制MCT4进而在预防肝癌中发挥重要作用。

白头翁皂苷B4对肝癌细胞Huh-7及其荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用及机制研究

目的:研究白头翁皂苷B4(AB4)对肝癌细胞Huh-7及其荷瘤裸鼠肿瘤的抑制作用及机制。方法:将Huh-7细胞分为AB4给药组、阴性对照组(等体积培养液)、阳性对照组(5-氟尿嘧啶50μmol/L),运用MTT法检测0、3、6、12、25、50、100、200、400、800、1 600μmol/L AB4作用Huh-7细胞12、24、36、48 h的增殖抑制率,计算半数抑制浓度(IC50);克隆形成试验评估50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的克隆细胞数;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)染色检测50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的细胞凋亡率;Western blot法检测50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h后B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、活化胱天蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)等凋亡蛋白的表达。将荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(5-氟尿嘧啶50 mg/kg)和AB4低、中、高剂量组(25、50、100mg/kg),每组3只,每天腹腔注射相应药物1次,连续19 d,观察裸鼠肿瘤生长情况,计算抑瘤率;苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤细胞形态变化。结果:AB4对Huh-7细胞的增殖抑制率随给药浓度的增加而增加,但50μmol/L后增加不明显,随作用时间的延长而增加,但作用24 h后增加不明显,AB4的IC50为(56.76±1.756)μmol/L。与阴性对照组比较,50μmol/L AB4作用Huh-7细胞24 h的克隆细胞数明显减少、Bcl-2蛋白表达明显减弱(P<0.05),细胞凋亡率和Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达均明显增加(P<0.05或P<0.01),且与阳性对照组差异无统计学意义。与阴性对照组比较,AB4低、中、高剂量组和阳性对照组荷瘤裸鼠的瘤体积明显减小(P<0.05),肿瘤细胞轮廓逐渐模糊,出现核固缩、核质不清晰、核碎裂现象,其抑瘤率分别为25.93%、39.15%、46.26%、42.83%。结论:AB4对Huh-7细胞及其荷瘤裸鼠均有抑制作用,其机制可能与上调Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3、裂解PARP、诱导细胞发生凋亡有关。

应用C-to-G碱基编辑器对PCSK9基因靶向敲除的研究

目的:使用C-to-G碱基编辑器(CGBE)Td-CGBE-NG靶向敲除huh-7肝癌细胞系前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因,以CBE(AncBE4max)为参照,评价Td-CGBE-NG对该基因的敲除效果。方法:使用引入终止密码子的策略敲除huh-7肝癌细胞系PCSK9基因。构建碱基编辑器Td-CGBE-NG和AncBE4max,构建重组质粒sg386和sg555,将Td-CGBE-NG和sg386,AncBE4max和sg555分别共转染huh-7细胞,实现c.1447C>G和c.1953C>T的转换,在两位点引入终止密码子S386X(TGA)和Q555X(TAG),使用sanger测序和T载体克隆验证编辑效率;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PCSK9基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:sanger测序和T载体克隆结果显示,Td-CGBE-NG和AncBE4max的编辑效率分别为c.1447C>G 33%和c.1953C>T 25%;RT-qPCR结果显示,Td-CGBE-NG使PCSK9 mRNA的表达量降低(t=17.29,P<0.0001);Western blot结果表明,两组huh-7细胞蛋白表达量均明显下降(AncBE4max:t=5.57,P<0.01;Td-CGBE-NG:t=4.912,P<0.01)。结论:Td-CGBE-NG可以有效敲除huh-7肝癌细胞系的PCSK9基因,抑制该基因mRNA和蛋白的表达,为后续Td-CGBE-NG的应用奠定基础。