姜黄素联合阿霉素对肝癌PLC/PRF/5细胞增殖凋亡及化疗药物增敏的作用及机制研究

目的探讨姜黄素联合阿霉素对肝癌PLC/PRF/5细胞增殖、凋亡及化疗药物增敏的作用,及其可能的作用机制。方法根据不同的干预药物将细胞分为3组,对照组、阿霉素组、姜黄素联合阿霉素组(联合组),MTT法检测3组肝癌PLC/PRF/5细胞增殖抑制率,RT-PCR检测肿瘤细胞Caspase-3基因的表达,TUNEL免疫荧光检测肿瘤组织凋亡细胞数,比较裸鼠进行不同药物治疗前后肿瘤组织的体积及治疗前后的体积差。结果阿霉素组细胞抑制率高于对照组(P <0. 05),联合组细胞抑制率高于阿霉素组(P <0. 05);阿霉素组Caspase-3基因表达高于对照组(P <0. 01),联合组Caspase-3基因表达高于阿霉素组(P <0. 01);在相同视野范围内,阿霉素组凋亡的肿瘤细胞数多于对照组(P <0. 05),联合组凋亡的肿瘤细胞数多于阿霉素组(P <0. 05)。三组裸鼠治疗前肿瘤体积比较差异无统计学意义(P> 0. 05),阿霉素组治疗后肿瘤体积及治疗前后体积差均小于对照组(P<0. 01),联合组肿瘤体积及治疗前后体积差均小于阿霉素组(P <0. 01)。结论姜黄素与阿霉素联合使用较单独使用阿霉素能增加PLC/PRF/5细胞的药物敏感性,这种作用可能与二者联用后能有效抑制PLC/PRF/5细胞增殖、促进PLC/PRF/5细胞的凋亡有关。

敲除ARID1A对人肝癌细胞系PLC/PRF/5基因表达调控的影响

目的探讨肝癌细胞系PLC/PRF/5中敲除ARID1A后对基因表达调控的影响。方法利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除PLC/PRF/5细胞中ARID1A。然后分别对PLC/PRF/5 ARID1A野生型与敲除型细胞进行全转录组测序分析(RNA-seq),并用DESeq2鉴定ARID1A敲除后差异表达基因。最后,使用Metascape数据库对差异表达基因进行GO功能富集分析。结果成功构建PLC/PRF/5 ARID1A敲除细胞系。利用RNA-seq共筛选出978个差异表达基因,包括480个表达上调差异基因和498个表达下调差异基因。GO功能富集分析显示差异表达基因主要集中在细胞黏附、激素水平调节、激素代谢和MAP激酶活性调节等生物学过程。结论PLC/PRF/5肝癌细胞中,ARID1A可调控大量基因的表达,为进一步研究ARID1A在肝癌发生发展中的作用机制提供了新的线索。

肝星状细胞条件培养基对肝癌细胞PLC／PRF／5耐药性的影响及其机制

目的:探讨肝星状细胞条件培养基(hepatic stellate cell conditioned medium,HSC-CM)对人肝癌PLC/PRF/5细胞耐药性的影响及其可能的机制。方法:用无血清RPMI 1640培养肝星状细胞LX-2,使其在缺营养的环境下活化,收集其条件培养上清即为HSC-CM。PLC/PRF/5细胞在HSC-CM条件下培养24 h后,顺铂处理12 h或24 h,采用流式细胞术检测PLC/PRF/5细胞的凋亡情况,MTT法检测PLC/PRF/5细胞的增殖,real-time PCR检测PLC/PRF/5细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)相关基因的表达水平。结果:顺铂组12和24 h两个时间点PLC/PRF/5细胞的凋亡率为(22.34±1.12)%和(26.78±1.56)%;HSC-CM+顺铂组细胞的凋亡率为(17.22±1.42)%和(21.52±1.76)%,顺铂组细胞凋亡率显著高于HSC-CM+顺铂组(P<0.05)。同在这两个时间点,顺铂组和HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞的增殖活性分别为(68.65±2.56)%和(79.47±1.43)%,(46.54±3.65)%和(62.77±2.89)%,HSC-CM+顺铂组细胞增殖活性均高于顺铂组(P<0.05)。Real-time PCR结果显示,与顺铂组相比较,HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞中上皮标记物钙黏蛋白(E-cadherin)的表达下降(P<0.05),而间质细胞标记物神经黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)以及EMT相关转录因子Snail和ZEB1的表达显著上调(P<0.01)。结论:HSC-CM可能通过诱导PLC/PRF/5细胞发生EMT,从而增强PLC/PRF/5细胞对顺铂的抵抗作用。

pLKO.1-shSIRT7重组质粒的构建及其对人肝癌PLC/PRF/5细胞系增殖的影响

基于近年来研究发现sirtuin 7 (SIRT7)与肝癌密切相关,为此,本研究获取SIRT7基因敲除小鼠的肝细胞基因表达谱数据,在m RNA整体水平上分析SIRT7在肝细胞中的作用;另外,构建特异性下调人SIRT7基因的短发夹RNA (shRNA)表达质粒,并初步研究SIRT7基因沉默对肝癌PLC/RPF/5细胞系的影响。应用DAVID、GSEA、Cytoscape等生物信息学相关工具分析基因表达谱数据。基于pLKO.1空载质粒构建p LKO.1-sh SIRT7重组质粒并通过酶切和测序鉴定。使用Lipofectamin 2000转染重组质粒进入PLC/RPF/5细胞,并通过PCR和Western blotting验证SIRT7基因的沉默效率。通过MTT实验检测细胞增殖能力的改变和流式细胞术检测细胞周期的变化,并使用PCR检测鉴定CDC4、TK1、CDC34、BCL2等基因表达水平的变化。基因表达谱分析结果显示,SIRT7基因敲除后,基因mRNA整体水平变化主要集中在与细胞周期、细胞凋亡等相关的通路中。重组质粒酶切与测序结果显示,成功构建了pLKO.1-shSIRT7重组质粒。转染后PLC/RPF/5细胞SIRT7基因的表达得到有效沉默,与对照组相比,沉默SIRT7基因的表达可导致细胞的增殖能力降低并引起G0/G1期的细胞比例增多,PCR实验显示CDC4与BCL2表达水平增高,TK1与CDC34表达水平降低。以上研究结果提示,在肝癌PLC/RPF/5细胞系中沉默SIRT7的表达可使更多的细胞阻滞在G0/G1期,从而降低其增殖能力,其机制可能与引起细胞周期相关基因的表达改变有关。

钙离子、镁离子对戊型肝炎病毒感染PLC/PRF/5细胞的影响

为检测钙离子、镁离子对戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染PLC/PRF/5细胞(人肝癌亚历山大细胞)的影响,本研究在各实验组PLC/PRF/5细胞的培养体系中加入等量HEV毒种进行孵育,利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应以及酶联免疫法,监测HEV核酸和抗原含量;在HEV感染细胞实验组的维持培养液中分别加入钙离子、镁离子、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA),观察钙离子、镁离子、EDTA和EGTA分别存在以及钙离子、镁离子同时存在的情况下,HEV感染后不同时间PLC/PRF/5细胞内及培养上清液中HEV含量。结果显示,HEV接种细胞后1~24h,钙离子、镁离子的加入能够促进病毒与细胞的结合,而金属离子鏊合剂的加入抑制了病毒与细胞的结合。HEV感染后2~5周,钙离子、镁离子均能增加PLC/PRF/5细胞培养上清液中产生的病毒,其中钙离子的促进作用更加显著。本研究结果表明钙离子、镁离子能够促进HEV感染细胞,在HEV接种细胞后的培养过程中,添加钙离子、镁离子有助于病毒产生。

NVP-BEZ235诱导自噬在肝癌细胞凋亡中的作用研究

目的以Hep3B和PLC/PRF/5两种肝癌细胞为研究对象,探讨自噬在NVP-BEZ235中引起细胞凋亡的作用.方法人类肝癌细胞Hep3B和PLC/PRF/5在含有10%FBS的DMEM培养基中进行培养,然后再进行细胞活性检测,用于Western blotting检测及线粒体膜电位(MMP)分析.结果 NVP-BEZ235能够有效增加LC3-Ⅱ的表达,并同时降低p62的表达,由此推断,NVP-BEZ235也能够诱导产生自噬,与Atg5的siRNA或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合应用时,肝癌细胞的生长被抑制.结论 NVP-BEZ235与Atg5的siRNA或者3-MA的联合应用能够促进细胞凋亡,NVP-BEZ235和自噬抑制剂的联合应用可为肝癌和其他恶性肿瘤临床治疗提供新的方法.

6MV-X射线对肝癌细胞凋亡及周期分布的影响

目的:研究人肝癌细胞接受不同剂量或时间的6MV-X线照射后,对细胞凋亡和周期进程的影响。方法:用流式细胞术检测6MV-X线照射4Gy后不同时间以及不同剂量6MV-X线照射后24h HepG2和PLC/PRF/5两种细胞的细胞凋亡和周期分布状况。结果:4Gy 6MV-X线照射后24h,HepG2细胞凋亡率高于PLC/PRF/5细胞,分别为(7.61±0.77)%和(5.63±0.87)%(P<0.05),且随时间和剂量增加,差异越显著;HepG2细胞受4Gy照射后12h,G0/G1期比例下降,为(40.56±1.59)%,后逐渐上升,G2/M期比例增高,为(13.28±1.02)%,随后逐渐下降;2-6Gy照射24h后,G0/G1期比例逐渐上升,G2/M期比例逐渐下降;PLC/PRF/5细胞G2/M期比例在照射后24h阻滞最明显(22.11±1.48)%,后逐渐降低,随照射剂量增加而增大。结论:2-6Gy 6MV-X线照射可诱导HepG2与PLC/PRF/5细胞凋亡,并改变周期进程,HepG2细胞发生G1和G2期阻滞,PLC/PRF/5发生G2期阻滞。

淋巴细胞-肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征及意义

目的:探究淋巴细胞和肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征及意义。方法:以人肝癌细胞株PLC/PRF/5与人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)形成cell-in-cell胞内嵌合结构为研究模型,采用流式细胞术分析淋巴细胞钻入肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征。利用流式分选技术分选出小鼠脾淋巴细胞与PLC/PRF/5细胞形成的cell-in-cell胞内嵌合结构,利用平板克隆形成实验检测cell-in-cell胞内嵌合结构对PLC/PRF/5细胞生物学行为的影响。结果:4 h和8 h时,以CD3/CD28抗体活化的PBMC对PLC/PRF/5细胞的伸入率分别为(15.75±1.28)%、(13.49±1.23)%,明显高于未活化PBMC的伸入率[(10.56±0.57)%,(11.38±0.97)%;P<0.05];且活化的PBMC在4 h时的伸入率明显高于未活化PBMC在8 h时的伸入率(P<0.05)。小鼠脾淋巴细胞伸入PLC/PRF/5细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构后,PLC/PRF/5细胞的克隆形成率明显高于未形成cell-in-cell胞内嵌合结构的PLC/PRF/5细胞[(32.25±2.32)%vs(21.92±2.02)%,P<0.05]。结论:活化后PBMC伸入PLC/PRF/5细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的比率升高、时间提前,同时形成胞内嵌合结构的肿瘤细胞在体外克隆形成能力增强。

女贞子提取物抑制人肝癌细胞血管生长因子表达作用研究

目的:研究女贞子提取物中熊果酸对人肝癌细胞生长抑制作用及对血管内皮生长因子(VEGF),转化生长因子-α(TGF-α)表达的抑制作用,探讨其抗肿瘤机制。方法:女贞子提取物与PLC/PRF/5细胞孵育,以四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测其对人肝癌细胞PLC/PRF/5生长的抑制作用,并通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞培养上清液中VEGF,TGF-α的表达;小鼠右前肢腋皮下接种瘤细胞,连续给药14 d后取瘤组织,检测小鼠肿瘤的抑制率,并以免疫组织化学方法检测瘤组织VEGF,TGF-α表达。结果:女贞子提取物中的熊果酸在体内和体外试验结果均显示抑制人肝癌细胞生长,并对VEGF,TGF-α表达有明显的抑制作用。结论:女贞子提取物具有抗肿瘤作用,抑制VEGF,TGF-α表达可能是其抗肿瘤作用机制之一。

肝原位移植瘤裸鼠模型的建立及活体荧光成像检测

目的建立能够通过活体荧光成像系统实时监测肿瘤进展的肝原位移植瘤裸鼠模型。方法重组质粒pcDNA3.1-Luc转染细胞构建稳定表达荧光素酶的PLC/PRF/5肝癌细胞株,将该细胞注入裸鼠肝脏实质内,应用活体成像技术动态监测肿瘤进展情况,解剖荧光信号阳性裸鼠观察肿瘤组织生长情况。免疫荧光检测肿瘤组织中HBsAg表达。结果对裸鼠肝原位移植瘤应用活体荧光系统成像,在肿瘤细胞注射部位检测到荧光信号,解剖动物后可在肝脏组织中观察到异质细胞团块。免疫荧光证实移植瘤中有HBsAg表达。结论肝脏原位移植瘤裸鼠模型建立成功,为抗肝癌药物的研发提供了工具。