肝素寡糖抑制CoCl_(2)诱导的HUVEC细胞糖酵解及其机制

以CoCl_(2)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立细胞异常缺氧损伤模型,探究肝素寡糖(HDO)对HUVEC细胞中糖酵解的影响及分子机制。实验分为对照组(无血清DMEM培养基)、模型组(无血清DMEM培养基+50μmol/L CoCl_(2))及HDO给药组(模型组基础上分别添加0.01、0.1、1μmol/L HDO)。采用生化试剂盒检测HDO对HUVEC细胞葡萄糖摄取及乳酸积累的影响;采用Western blot及qPCR实验检测HIF-1α、GLUT-1及LDHA基因转录和蛋白表达的影响,并对PI3K/Akt信号通路进行检测。结果显示:HDO可以抑制HUVEC细胞的葡萄糖摄取及乳酸生成,下调HIF-1α、GLUT-1及LDHA的表达水平,影响PI3K/Akt信号通路的激活。结果表明,HDO可以通过抑制PI3K/Akt/HIF-1α信号轴的激活从而调控HUVEC细胞的糖酵解水平。

含N-乙酰化肝素寡糖的制备及序列分析

建立了含N-乙酰化肝素寡糖的分离提纯及其序列结构分析方法。首先应用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素来富集含N-乙酰化结构寡糖,通过Bio-Gel P10凝胶色谱法分离制备了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗样品,Pro Pac PA-1强阴离子高效液相色谱(SAX-HPLC)等方法对粗样品进一步分离,提纯得到4种六糖和3种八糖片段。其次应用肝素酶Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ复合酶解与HPLC法分析各纯化寡糖的二糖组分,并结合肝素酶Ⅰ底物特异性,初步推断4种六糖和3种八糖的序列结构。在寡糖的糖链两端均含有N-硫酸化二糖,而N-乙酰化二糖分布在糖链当中。应用电喷雾离子阱-飞行时间质谱(ESI-IT-TOF-MS)在负离子模式下进一步表征寡糖并分析其裂解规律。结果表明,各寡糖中均出现大量因SO2!3丢失形成的碎片离子峰,六糖中主要有双电荷和三电荷碎片离子峰;在八糖中出现了一系列从双电荷至五电荷的离子峰。各寡糖的双电荷离子峰质荷比进一步确定了上述寡糖的序列结构。六糖的裂解规律表明,裂解主要存在于糖苷键,N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分别为0,2X和0,2Z。本研究提供了切实有效的分离、分析未知结构肝素寡糖序列的新方法。

过氧化氢降解肝素制备肝素寡糖的工艺研究

以收率为考核指标,采用正交试验筛选出过氧化氢降解肝素制备相对分子量为1.2～2kD的肝素寡糖的最佳工艺条件。结果表明,优化条件为55℃、pH 7.0时一次性加入过氧化氢使其浓度达12%。

低抗凝肝素寡糖的制备、结构表征及免疫活性评价

以猪肠黏膜来源低抗凝肝素为原料,采用苄酯碱水解法制备了寡糖.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）-多角激光光散射法（MALLs）联用、核磁共振波谱（NMR）和液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术对所制备寡糖的分子量分布及化学结构进行了表征.以该寡糖对活化X因子（FXa）及人凝血酶（FⅡa）活性的抑制作用评价了其抗凝血活性,并通过测定其对RAW264.7巨噬细胞吞噬能力及NO释放量的影响评价其免疫活性.结果表明,所制备寡糖的聚合度分布于2~22之间,平均分子质量为5300,无明显的抗凝血活性,但具有显著的免疫增强活性.

牛肺肝素寡糖的制备

利用肝素酶 (Heparinase I,EC4 .2 .2 .7)对牛肺肝素进行控制酶解 ,混合寡糖经超滤、凝胶渗透色谱和高压液相色谱技术分离制备后 ,得到聚合度为 2 ,4 ,6 ,8,10 ,12 ,14和 2 0的寡糖纯品。各寡糖纯度采用毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检验 ,寡糖结构采用核磁共振氢谱证实。

肝素寡糖对人外周血T细胞分泌白介素-4和白介素-5的影响

目的研究肝素寡糖(Oligs)对人外周血T细胞(PBTLs)分泌白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)的抑制作用。方法用3种方法降解肝素并用凝胶过滤色谱法制备肝素寡糖。抽取10例过敏性嗜酸粒细胞性胃肠炎患者的PBTLs用植物凝集素(PHA)和Oligs处理,用ELISA法测定PBTLs培养的上清液分泌IL-4和IL-5的含量。结果Oligs样品浓度5μg/mL时,可显著抑制PBTLs对细胞因子IL-4、IL-5的分泌。但是,不同相对分子质量(Mr)的Oligs对IL-4和IL-5具有不同的作用。对IL-4抑制作用最强的是用过氧化氢降解肝素所得Mr为1 142的四糖。抑制IL-5作用最强的是用β-消除法降解肝素所得Mr为1 806的六糖。结论Oligs对人PBTLs分泌IL-4和IL-5的抑制作用与分子结构密切相关,并且有一个基本结构。对IL-4和IL-5抑制作用最强的分别是四糖和六糖。

类肝素寡糖/多糖衍生物抗凝血材料的研究进展

综述了近年来有关类肝素寡糖以及壳聚糖、透明质酸、软骨素等硫酸 /磺酸化衍生物抗凝血性的研究进展 ;介绍了一些来源于植物的木聚糖、直链淀粉、纤维素、凝胶多糖硫酸化衍生物用于抗凝血的研究 。

肝素寡糖对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响及分子机制研究

以脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞HUVECs炎症损伤,探讨肝素寡糖对炎症的影响及其分子机制。实验分为空白组(0.5%血清培养基)、模型组(LPS+0.5%血清培养基)及给药组(LPS+0.5%血清培养基+0.01、0.1、1μmol/L HDO),采用活性氧实验检测细胞内活性氧簇水平,Western blot检测VCAM-1、p38、p-p38及核转录因子NF-κB等关键蛋白的表达水平。结果显示0.01、0.1和1μmol/L的HDO可抑制100μg/m L LPS诱导的HUVECs炎症因子VCAM-1表达水平,较弱的影响细胞中NF-κB分布,并下调信号通路中关键蛋白p38和p-p38表达。结果表明,HDO可能通过抑制炎症信号通路中关键蛋白的表达水平来抑制炎症因子的表达,从而起到抗炎作用。

肝素寡糖通过抑制PKC-α影响血管平滑肌细胞增殖的作用(英文)

为考察肝素寡糖对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用,并探索其相关细胞内信号转导机制,采用cell-based ELISA法、RT-PCR法、Western blotting法和免疫细胞化学法检测细胞内PKC-α蛋白水平和mRNA水平;采用RT-PCR法检测c-jun、c-myc和c-fos等3种原癌基因的mRNA水平。结果显示,肝素寡糖可以抑制新生牛血清诱导的PKC-α和原癌基因的表达,这可能是肝素寡糖抑制血管平滑肌细胞增殖的机制之一;流式细胞实验结果显示,肝素寡糖能将细胞阻滞于G0/G1期,从而阻断细胞周期进程。综上所述,肝素寡糖可能通过抑制PKC-α表达,进而抑制原癌基因的表达,阻断细胞G1/S期转换,从而抑制血管平滑肌细胞的增殖。

肝素寡糖的制备及其对平滑肌细胞抗增生作用的初步研究

制备肝素寡糖并初步研究其对平滑肌细胞增生的作用。采用Bio-GelP6凝胶色谱分离纯化低分子肝素,制备不同Mr的肝素寡糖并比较其对平滑肌细胞增生的作用。结果表明,分离得到的平均Mr约3200的肝素寡糖,具有明显抑制平滑肌细胞增生的作用,其抗FXa效价为48·90ant-FXaIU/ml。

肝素寡糖抑制血小板衍生生长因子诱导平滑肌细胞增殖机制的研究

本实验研究了肝素寡糖(HDO)对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响,并对其作用机制进行初步探讨。实验分为空白组、模型组及肝素寡糖组。采用MTT法和流式细胞仪检测HDO对VSMCs增殖活性及其细胞周期分布影响,Western blot、免疫组化和RT-PCR检测PKC、MAPK、Akt/PI3K信号通路中PKC-α、p-Akt、p-ERK1/2、p-GSK-3β和p-PDK1等关键蛋白及c-fos、c-myc、c-jun等原癌基因的表达水平,结果显示,HDO(0.01、0.1和1μmol·L-1)可浓度依赖性抑制30 ng·m L-1 PDGF诱导的VSMCs增殖活性,阻滞细胞周期G1/S期转换,并下调信号通路中关键蛋白及原癌基因表达(均为P<0.05)。结果提示,HDO可能通过抑制信号通路中关键蛋白的表达水平从而抑制原癌基因表达和G1/S期转换,进而抑制VSMCs增殖。

梯度电泳制备肝素寡糖

低分子肝素是通过酶解或化学降解的方法得到分子量较小的普通肝素片断,较普通肝素抗凝血作用小,出血等不良反应发生率低,是一类很有价值的药物。本文采用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳对低分子质量肝素进行纯化,从凝胶中回收肝素寡糖片段,并通过高效凝胶渗透色谱法测定回收样品的相对分子质量。结果制备得到平均M_r约为3019的肝素寡糖。

肝素寡糖抑制血管内皮细胞生长的机制研究

动脉粥样硬化(AS)是一种常见的血管疾病,被认为是脑梗死常见的原因之一。以前的观点认为,AS是机体脂质代谢障碍的结果,但随着深入的研究,目前大多数学者认为AS是血管炎症性损伤的一种表现行为,认为其是内皮细胞功能发生紊乱后的炎症反应并在此基础上形成的一种损伤-修复过程。肝素作为抗凝血和抗血栓药物已被广泛应用。研究发现其还具有降血脂、抗炎、抗过敏抗肿瘤等多种生物学功能。而肝素寡糖被认为是由低分子肝素通过酶法、化学方法等降解得到的低分子肝素,然后再通过分离纯化得到。本实验考察肝素寡糖对内皮细胞增殖的影响及可能的机制。采用MTT法检测肝素寡糖对血清、血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响;采用流式细胞仪检测肝素寡糖对HUVEC凋亡的影响;采用Western blot法检测肝素寡糖对HUVEC内VEGF表达的影响。结果显示在血清、血管内皮生长因子诱导下,肝素寡糖对HUVEC的增殖有抑制作用,肝素寡糖可以诱导其凋亡,并且可降低细胞内VEGF的表达。以上结果为研究肝素寡糖抑制HUVEC增殖的可能分子机制奠定一定的理论基础。

肝素十二糖对血管平滑肌细胞增殖作用的研究

目的:研究肝素十二糖(dp12)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖作用的影响,并分析其分子水平的作用机制。方法:通过以10%新生牛血清诱导牛胸主动脉血管平滑肌细胞增殖建立模型,然后考察实验室精制的不同浓度的肝素寡糖对血管平滑肌细胞增殖作用的影响;四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测dp12对VSMCs增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR法检测ERK1/2转录变化情况;Western Blotting法检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达。结果:MTT结果显示不同浓度的dp12可以明显抑制由10%新生牛血清诱导的血管平滑肌细胞的增殖;细胞周期实验揭示dp12抑制血清诱导的VSMCs从G1期进入S期,影响细胞周期;dp12通过下调ERK基因的转录进而下调ERK1/2的表达,此外dp12抑制ERK1/2的磷酸化进而影响细胞增殖。结论:dp12使VSMCs在G1期/S期阻滞,通过抑制ERK基因的转录和ERK蛋白的磷酸化抑制VSMCs增殖,可能是dp12抗VSMCs增殖的机制之一。

酶法精准合成活性类肝素寡糖

肝素是一类重要的人源直链硫酸化多糖,作为重要的抗凝血和治疗血栓性疾病的临床药物被广泛使用。近年来,肝素的糖链结构所蕴含的生物信息引起了广泛关注,其抗菌和抗炎等其他生物学功能也逐渐被揭示。然而,目前肝素类药物的生产主要依赖于动物组织提取,这导致了产品结构的异质性、潜在的污染风险以及质量控制的复杂性。此外,尽管全化学合成肝素的方法存在,但其合成过程繁琐,且合成的糖链长度有限,难以满足临床药物对结构多样性的需求。因此,通过酶促级联反应实现活性类肝素寡糖的精准合成,为解决当前肝素类药物面临的问题提供了一种有效的策略。本文系统综述了类肝素寡糖酶法合成体系的最新研究进展。

脱水糖苷化方法合成肝素酶底物寡糖

乙酰肝素酶(Heparanase,Hpa)是哺乳动物体内的内切葡萄糖醛酸苷水解酶,通过水解葡萄糖醛酸(Glc A)与己胺糖(Glc N)之间的β-糖苷键,选择性地降解肝素和硫酸肝素糖胺聚糖,从而释放多功能的肝素寡糖.本文报道一条高效的肝素酶底物寡糖的合成路线:采用苯甲酰基保护待硫酸化的羟基,苄基保护羧基和裸露的羟基,叠氮基保护氨基,应用脱水糖苷化方法高效地构建关键的α-GlcN-(1→4)-Glc A糖苷键.然后通过标准化的保护基脱除和硫酸化操作,获得肝素酶底物三糖和四糖1-4.最后五步反应的总收率超过52%.肝素酶底物寡糖的合成为研究肝素酶的底物选择性和活性检测打下了基础.

肝素三糖和四糖衍生物的高立体选择性合成

肝素是一种高度硫酸化的天然黏多糖类物质,可以介导各种生理和病理过程,临床上主要用于预防和治疗静脉血栓症.本文报道了一条利用正交保护基策略,高立体选择性合成肝素寡糖的路线,获得7个氨基葡萄糖基6-O-硫酸化修饰程度不同的肝素三糖和四糖衍生物(28~34).该路线采用叔丁基二苯基硅基(TBDPS)作为叠氮葡萄糖砌块伯羟基的保护基,利用N-苯基三氟乙酰亚胺酯给体,实现了关键的GlcN-(1→4)-GlcA糖苷键的高α选择性的构建;利用[1+2]和[2+2]糖苷化策略,合成了4个全保护的肝素三糖和四糖前体;采用优化的保护基脱除和硫酸化操作,高效便捷地获得目标肝素三糖和四糖.这一系列肝素寡糖衍生物在还原端带有氨基为端基的连接臂,为制备肝素类寡糖芯片,系统性研究肝素寡糖与蛋白,如乙酰肝素酶的相互作用打下了基础.