纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽的制备及其对DIC大鼠的治疗作用

本研究利用酵母表达系统制备纤维连接蛋白(fibronectin,FN)N端肝素结合域多肽,检测多肽的生物学活性,进行多肽治疗DIC大鼠的实验研究。利用PCR技术从FNcDNA中扩增FN N端肝素结合域序列,将获得的目的基因片段克隆至T载体,筛选后转移至酵母表达pAo815SM载体进行选择,再构建重组酵母表达pPIC9K载体,线性化重组载体并转染GS115酵母细胞,在GS115酵母细胞表达目的多肽。发酵液经80%硫酸胺沉淀,沉淀物过S-100柱分离纯化,纯化物再经过SP柱纯化,测定多肽结合肝素等生物学活性。股静脉注射内毒素脂多糖(LPS)50mg/kg建立大鼠DIC模型。建立的DICSD大鼠40只,随机分2组,每组20只,一组为rhFNHN-29多肽治疗组,另一组为生理盐水对照组。治疗组分别于注射LPS前半小时、注射后2小时、4小时尾静脉注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg);生理盐水对照组注射等体积生理盐水。另设正常对照组SD大鼠20只,注射等体积生理盐水作为正常对照组。各组大鼠于股静脉注射LPS后6小时,对侧股静脉抽血测血常规,分离血浆检测血浆TNFa和凝血象。于注射LPS后72小时处死大鼠,取肝、肾、脾、肺、心、脑组织进行病理组织学检查。结果表明:成功地在酵母表达系中表达了目的多肽,其表达量达到30mg/L,所表达的多肽具有结合肝素活性。在多肽抗DIC作用的动物实验中发现多肽治疗组的血浆TNFa水平、血常规指标、凝血象和病理组织学的改变都较生理盐水对照组更接近正常对照组。结论:成功地制备了rhFNHN-29多肽,这种多肽能在一定程度上预防和治疗DIC。

纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽在毕赤酵母中的表达、纯化及鉴定

为在毕赤酵母中表达纤维连接蛋白C端肝素结合域(Fibronectin C-terminal heparin-binding domainFNCHBD)多肽并研究其功能,通过PCR技术扩增FNCHBD目的基因,将目的基因与T载体连接,经测序正确后,插入pAo815SM酵母表达载体增加基因拷贝数,然后酶切克隆入酵母表达载pPIC9K;将重组质粒Sal I酶切线性化后转化毕赤酵母菌株,筛选工程菌,经甲醇诱导表达,用SDS-PAGE检测发酵上清液,表明有重组蛋白FNCHBD多肽的高表达,表达产物通过离心、超滤、离子交换层析纯化,纯化产物通过SDS-PAGE、Western blotting印迹、质谱及肝素亲和层沉析对表达产物进行鉴定。结果表明利用酵母工程菌成功表达和纯化了FNCHBD多肽,多肽的分子量接近32 kDa,纯化产物的纯度可达95%以上,能被FN多克隆抗体特异识别且具有多肽肝素结合活性,为后续结构及功能的研究奠定基础。

纤维连接蛋白肝素结合域多肽在昆虫表达系中表达及活性鉴定

目的:将纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域基因片断克隆至昆虫表达系统中进行表达,分离纯化所表达多肽并进行多肽结合肝素、FN抗原性和抗血小板减少内毒素血症活性鉴定。方法:用高保真PCR技术从FNcDNA中扩增目的基因片段,将目的基因片段克隆至昆虫表达系的Bac-to-Bac HT Vector,在E.coliDH5α中抗氨苄青霉素选择,挑选阳性菌斑通过PCR、酶切鉴定和DNA序列测定,确定无误,再扩增提取质粒,进一步转染MAX Efficiency DHIOBac^(TM)Competent E.coli,经三种抗菌素(卡那、庆大、四环素)联合IPTG、X-gal蓝白斑选择,挑取阳性白色菌斑提取质粒,PCR、酶切鉴定和DNA序列测定,确定无误,转染Sf 9昆虫细胞获取重组杆状病毒,重组杆状病毒再次转染Sf9昆虫细胞表达多肽。裂解Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE分析裂解上清,镍离子亲和树脂分离纯化表达的多肽,Western blot鉴定多肽结合肝素和FN抗原性活性。动物实验探讨rhFNHC-36多肽抗血小板减少内毒素血症的作用。结果:纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域多肽均在昆虫表达系统中得到表达,所表达的多肽具有与肝素结合的能力而不具FN抗原性。动物实验初步显示rhFNHC-36多肽具有抗血小板减少内毒素血症的作用。结论:在昆虫表达系统中表达纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域多肽是可行的,所表达多肽具生物活性,但表达量尚较低,有待进一步优化表达以提高表达量。

纤维连接蛋白治疗败血症的研究进展

败血症是临床危重症，严重者可引起休克、弥散性血管内凝血和多器官功能衰竭。纤维连接蛋白是一种高分子质量多功能糖蛋白，它能调节单核-巨噬细胞系统的作用，在清除细菌性颗粒、激活凝血因子、纤维蛋白、微粒体、胶原碎屑及免疫复合物等方面起非特异调理作用。纤维连接蛋白同时还具有维持血管通透性作用，从而发挥抗感染、抗败血症的作用。

HBD的N端融合蛋白的跨膜转导作用

研究人源性穿膜肽HBD的N端融合蛋白的跨膜转导作用。通过DNA重组技术将HBD融合在EGFP蛋白的氨基端(N端),构建重组质粒pET28b-HBD-EGFP-Histag,经IPTG诱导表达和Ni 2+-NTA纯化,获得重组蛋白HBD-EGFP。通过激光共聚焦显微镜定性观察及流式细胞仪定量检测发现,融合在EGFP氨基端的HBD跨膜转导效率比融合在EGFP羧基端(C端)的HBD转导效率提高了约10倍。实验结果表明,N端融合的HBD-EGFP对于外源蛋白具有跨膜运输效果,且比C端融合的HBD具有更高的跨膜转导效率。该结果可为HBD在抗癌药物递送方面的有效应用提供理论依据。

一种用于肿瘤药物治疗的新型人源性穿膜肽的优化及其应用

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide,CPP）作为一种体内大分子药物跨膜运输载体被广泛研究和应用。中期因子Midkine（MK）是人体的一种带有肝素结合域（heparin-binding domain,HBD）的生长因子。报道了MK中HBD的部分富含碱性氨基酸的基因序列（命名为MK-S0）与绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合表达后,能将EGFP有效地转运入胞内,且其穿膜转运效率高于经典穿膜肽Tat。将MK-S0序列进一步突变优化改造得到的midkine-mutantΔ4（MK-Δ4）,其穿膜效率比天然序列来源的MK-S0提高16倍以上,且MK-Δ4的穿膜转运作用适用于多种肿瘤细胞。穿膜机制分析研究结果显示,MK-Δ4可与细胞表面硫酸乙酰肝素结合,随之以巨胞饮形式内吞入胞。采用MTT方法检测的细胞生长抑制试验结果显示,连接有MK-Δ4的苦瓜来源的核糖体失活蛋白MAP30比单独的MAP30对HeLa肿瘤细胞的药效可提升5.8倍,大大提高了这种药物蛋白抑杀肿瘤细胞的效果。由此表明,源于MK的这种经过突变改造的MK-Δ4,可作为一种新型高效的细胞穿膜肽,将药物蛋白有效运输到细胞内发挥抗肿瘤效应。