加味小柴胡汤对顺铂诱导大鼠肝BRL细胞过氧化损伤的保护作用

目的:探讨加味小柴胡汤对顺铂诱导大鼠肝BRL细胞氧化损伤的保护作用。方法:采用体外细胞培养方法,观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的BRL细胞生长、SOD、GSH-px、NOS活性、MDA、GSH、T-AOC含量的影响。结果:顺铂各剂量处理细胞OD值皆显著下降,且随剂量而加重;加味小柴胡汤大小剂量细胞OD值皆明显升高;顺铂组SOD、GSH-px、T-AOC活性、GSH含量均明显降低;MDA含量及NOS活性明显升高;两实验组SOD、GSH-px、T-AOC及GSH均较顺铂组升高,MDA及NOS降低,而以1组效果更显著。结论:顺铂可明显抑制肝细胞生长,诱致细胞过氧化损伤,加味小柴胡汤可提高细胞生长率,其作用与其明显的抗氧化能力有关,且有一定的量效关系。

黄药子及配伍当归含药血清对肝细胞毒性的实验研究

目的:观察分析黄药子及配伍当归含药血清对体外培养肝细胞存活率和GPT、GOT、LDH酶活性的影响。方法:采用体外实验法,待肝细胞贴壁生长后,加入含药和空白血清,使其终浓度为20%,检测GPT、GOT、LDH活性;同步以MTT法计算细胞相对存活率并观察肝细胞形态。结果:黄药子组正常肝细胞存活率明显下降,与空白组有显著性差异(P<0.05),配伍组细胞的存活率明显提高,与空白组无显著性差异(P>0.05);黄药子组GOT、GPT、LDH活性与空白组比明显升高(P<0.01),而配伍组LDH、GOT、GPT的活性受到抑制,与空白组无显著性差异(P>0.05)。结论:黄药子对正常大鼠肝细胞有明显细胞毒性,而当归对肝细胞有一定的保护作用。

抗纤软肝冲剂对肝星状细胞胶原降解相关基因表达的影响

目的从细胞分子水平研究抗纤软肝冲剂对肝星状细胞(HSC)胶原降解的影响。方法抗纤软肝冲剂药物血清温育传一代HSC,以生理盐水和秋水仙碱为对照。ELISA法测定细胞上清Ⅰ型胶原,并测定细胞层总蛋白以校正胶原含量;半定量RT-PCR法检测间质胶原酶(MMP1)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的mRNA表达。结果抗纤软肝冲剂组细胞上清中的Ⅰ型胶原含量明显低于其他两组(P<0.05或P<0.01);明显促进细胞MMP1的mRNA表达(P<0.05或P<0.01),显著抑制细胞TIMP-1的mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。结论抗纤软肝冲剂能促进MMP1基因表达,抑制TIMP-1基因表达,从而促进胶原降解,这可能是该方抗肝纤维化的细胞分子学机制之一。

脂糖舒对糖尿病大鼠肝功能的影响

目的观察脂糖舒对糖尿病大鼠肝功能的影响。方法腹腔注射链脲霉素制作糖尿病大鼠模型,用不同剂量脂糖舒(0.5g/kg和1.0g/kg)灌胃,1次/d,连续8周,并取健康大鼠作正常对照。测定各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性及葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和总胆红素(Bil)的含量;并测定肝组织中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性;称肝脏重量和体重及计算肝系数和白蛋白/球蛋白(A/G)比值。结果1模型组大鼠血清ALT、AST和肝组织LDH活性及血清Glu、TG、FFA和肝组织MDA含量及肝系数显著高于正常组,而血清Alb含量、A/G比值和肝组织SOD活性显著低于正常组;2与模型组比较脂糖舒两组血清ALT、AST和肝组织LDH活性及血清Glu、TG、FFA和肝组织MDA含量显著降低;而血清Alb含量、A/G比值及肝组织SOD活性显著升高;3与脂糖舒-1组比较脂糖舒-2组血清ALT、AST和肝组织LDH活性及血清Glu、TG、FFA和肝组织MDA含量显著降低,而肝组织SOD活性显著升高;4TP和Bil含量各组间无显著性差异。结论脂糖舒对糖尿病大鼠肝功能有明显的改善作用。

载阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒对L-02细胞的毒性研究

目的检验载阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(ADM-PBCA-NP)对人肝细胞株L-02细胞的毒性。方法体外培养人肝细胞株L-02,检测各组不同纳米粒浓度培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性;用噻唑蓝(MTT)法检测L-02在与ADM-PBCA-NP,阿霉素(ADM)和空白纳米粒(PBCA-NP)共同培养的条件下对肝细胞的毒性,通过对不同浓度PBCA-NP的溶血试验测定其生物相容性。结果MTT结果显示,ADM组,ADM-NP组,PBCA-NP组在10-6mol/L的浓度范围内,细胞毒性均为1级,即对细胞无害。各组肝细胞L-02培养上清液中LDH活性的测定无统计学差异。结论在10-6mol/L浓度范围内,ADM-NP和PBCA-NP对肝细胞L-02无明显毒性作用;在一定的浓度范围内细胞相容性良好,不会引起溶血。

神经生长因子诱导肝星状细胞凋亡及其相关机制的研究

目的观察神经生长因子（nerve growthfactor，NGF）对大鼠肝星状细胞（hepatic stellatecell，HSC）凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株HSC—T6，将HSC—T6与100ng／mlNGF孵育24h后，流式细胞术检测细胞凋亡；细胞免疫化学法检测HSC中凋亡相关基因P^53、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的情况；免疫荧光法检测NGF、神经生长因子低亲和力受体p75NTR表达的情况。结果NGF作用HSC后凋亡率较对照组明显增高[（22．364±9．51）％VS（5．88±1．36）％，P〈0．05]。凋亡相关蛋白P^53、Caspase-3的阳性细胞百分率与对照组比较明显增高[（78．41±4．00）％、（39．26±1．57）％VS（34．96±3．84）％、（9．27±1．01）％，P〈0．05]，而Bcl-2表达实验组阳性细胞百分率较对照组降低[（18．12±1．38）％vs（91．53±2．98）％，P〈0．05]。NGF作用HSC后NGF表达增多（6．53±1．40vs1．77±0．17，P〈0．05），而p75NTR表达无明显变化（3．52±0．36VS4．24±0．38，P〉0．05）。结论NGF可能通过使凋亡相关基因p、Caspase-3表达上调、Bcl-2表达下调，而诱导HSC凋亡。NGF作用HSC后可作为始动因子和效应因子增加NGF的表达，而对p75NTR表达无影响。

microRNA－21反义寡核苷酸对肝星状细胞胶原合成的影响

目的：探讨microRNA－21（ miR－21）反义寡核苷酸对肝星状细胞胶原合成的影响。方法肝星状细胞分离和培养，利用脂质体2000将miR－21反义寡核苷酸转染活化的肝星状细胞中，转染48 h后，收集肝星状细胞，采用实时RT－PCR法和Western blotting分别检测细胞miR－21表达和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达；MTT法检测转染后细胞增殖活性。结果与无关反义寡核苷酸组相比，miR－21反义寡核苷酸转染后miR－21表达较无关对照组下调约76％（ P ＜0．01）；细胞增殖活性降低（26±3）％（ P ＜0．01）；Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白分别降低（61±7）％和（48±6）％（均P ＜0．01）。结论 miR－21反义寡核苷酸能显著下调miR－21的表达，抑制肝星状细胞增殖及胶原的合成。

特异性miRNA-200b抑制剂对肝星状细胞生物学特性的影响

目的 观察特异性miRNA-200b抑制剂对肝星状细胞增殖、活化、胶原合成的影响.方法 设计并合成miR-200b抑制剂,利用脂质体将miRNA-200b抑制剂转入肝星状细胞中,培养48 h后,收集肝星状细胞和上清液,采用qRT-PCR探针的方法检测miR-200b的表达水平、Westernblotting检测细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达、噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活性和放射免疫法检测培养上清液中Ⅲ型前胶原和透明质酸含量.结果 与阴性对照组相比,miRNA-200b抑制剂转染48 h后HSC-T6细胞miR-200b组表达下调82％;α-SMA蛋白表达降低（19±3）％（P＜0.05）;细胞增殖活性降低（33±5）％（P＜0.01）;培养上清中Ⅲ型前胶原和透明质酸含量分别降低（35±4）％和（31±2）％（均P ＜0.01）.结论 miRNA-200b抑制剂下调HSC-T6细胞中miR-200b表达,抑制肝星状细胞增殖与活化,减少细胞外基质的合成和分泌.

MicroRNA-9通过下调TGFBR2表达抑制肝星状细胞增殖和胶原合成

目的探讨MicroRNA-9（miR-9）对肝星状细胞增殖和胶原合成的影响并研究其相关机制。方法设计合成miR-9特异性模拟物（miR-9mimics），将其转入肝星状细胞中，培养48h后收集细胞，采用实时定量PCR技术（qRT—PCR）验证miR-9mimics转染细胞中miR-9的变化水平、Westernblot检测I型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达、噻唑蓝（MTY）法检测细胞增殖情况；通过qRT—PCR和Westernblot检测转染miR-9mimics后其潜在靶点转化生长因子-01受体2（TGFBR2）韵表达水平。结果与对照组相比，转染miR-9mimics后，检测肝星状细胞中miR-9表达量明显升高（P〈0．05）。过表达miR-9后I型胶原、Ⅲ型胶原蛋白分别降低约（44±2）％和（50±3）％（P〈0．05），细胞增殖活性降低约（48±4）％（P〈0．01），TGFBR2的表达水平降低（P〈0．05）。结论过表达miR-9可抑制肝星状细胞胶原合成和细胞增殖，此机制可能是通过下调TGFBR2的表达来实现。

不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响及其调控机制的研究

目的探讨不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响及其调控机制的研究。方法用MTY法检测三组不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的抑制率，用免疫细胞化学法检测细胞周期素cyclinE的表达情况。结果MTT法检测不同药物浓度组：空白对照组、0．8mg／L甘草甜素组、1．2mg／L甘草甜素组、1．6mg／L甘草甜素组细胞增殖抑制率分别为0，2．73％，14．75％，25．96％，差异有统计学意义（P〈0．05）；不同浓度甘草甜素组中cyclinE阳性表达细胞数与对照组比较明显减少，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论甘草甜素能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖；甘草甜素可通过降低细胞周期素cyclinE的表达从而抑制大鼠肝星状细胞增殖。’

选择性抑制AP－1基因对雌激素诱导人肝细胞BSEP／NTCP表达的影响

目的：探讨活化蛋白－1（AP－1）对17β雌二醇（E2）诱导L－02人正常肝细胞中胆盐输出泵（BSEP）、钠－牛磺胆酸盐共转运多肽（ NTCP）表达的影响。方法培养雌激素诱导的人肝细胞，联合AP－1的RNA干扰技术、Real－time PCR及West－ern blotting等方法，确定AP－1对雌激素诱导的人肝细胞中BSEP、NTCP表达的影响。结果正常人肝细胞中BSEP及NTCP均有表达。雌激素可增强肝细胞中AP－1的表达。 siRNA1049有最佳沉默AP－1基因的作用，与空白对照组比较沉默效果明显（ P ＜0．05），转染24 h以后沉默效率70．0％。 AP－1基因表达水平在转染后24 h抑制明显，与阴性对照及空白对照组比较差异均有统计学意义（ P ＜0．05）。沉默AP－1表达可增强雌激素诱导肝细胞中BSEP、NTCP表达。干扰组中BSEP、NTCP mRNA及蛋白表达均高于空白对照组及未干扰组（ P ＜0．05），而空白对照组与未干扰组BSEP及NTCP表达比较差异均无统计学意义（ P ＞0．05）。结论特异性siRNA沉默AP－1可下调雌激素诱导下肝细胞BSEP及NTCP的表达。

血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞蛋白激酶Cε、Cα表达的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞蛋白激酶Cε(PKCε)、Cα(PKCα)表达的影响。方法采用不同浓度的血管紧张素Ⅱ处理HSC-T6细胞株,四唑盐(MTT)法检测HSC-T6细胞增殖,分析羟脯氨酸含量变化,免疫荧光染色检测PKCe和PKCα的表达,RT-PCR分析PKCε和PKCαmRNA的水平。结果不同浓度血管紧张素Ⅱ促进HSC-T6细胞增殖(F=25.321,P<0.001),上调羟脯氨酸水平(F=13. 283,P <0. 001),并呈现明显的剂量效应;伴随血管紧张素Ⅱ浓度的增加,PKCε表达明显增加(F=21.387,P<0.01),并发生转位于细胞膜;PKCα表达明显增加,尤以转位膜、胞浆比较明显(F=19.431,P <0. 01),并呈现明显的剂量效应;同时PKCε和PKCαmRNA水平增加(F=13. 279、15. 174,P<0.05)。结论血管紧张素Ⅱ能够剂量依赖性地上调肝星状细胞胶原表达,提高蛋白激酶Cε、Cα表达水平,促进肝星状细胞的增殖。

枳棋子水提取液对乙醇体外诱导脂肪变L-02细胞UCP2基因表达的影响

目的通过建立乙醇体外诱导的L-02肝细胞脂肪肝模型，探讨不同剂量的乙醇对肝脏脂肪变L-02细胞解偶联蛋白（Uncoupling protin2，UCP2）表达水平的关系，观察枳棋子水提取液对其表达的影响。方法建立肝细胞脂肪变模型，选最适合浓度枳棋子提取液进行干预，采用半定量RT．PCR法测各组UCP2mRNA表达量。结果各浓度脂肪变性模型中UCP2mRNA表达均有下降，经枳棋子水提取液干预后UCP2mRNA表达均有明显升高（0．6％乙醇组治疗后值由0．4859升至0．7442）。结论乙醇可降低L-02细胞UCP2mRNA的表达，UCP2mRNA的低表达可能与L-02细胞AFLD发生有关。枳棋子可使L-02细胞UCP2mRNA的表达上调，并推测UCP2mRNA的表达上调是枳棋子减轻酒精诱导肝细胞脂肪变性的机制之一。

姜黄素对肺纤维化大鼠肺组织TGF—β1与HGF表达的影响

目的探讨TGF—β1与HGF在肺纤维化中的作用及不同浓度姜黄素对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织中HGF及TGF—β1表达的影响。方法健康雄性SD大鼠90只，随机分为6组。分别为空白对照组（A组）、模型组（B组）、泼尼松治疗组（C组）、姜黄素50组（D组）、姜黄素100组（E组）、姜黄素200组（F组），应用气管内给予博莱霉素制作肺纤维化动物模型。造模7、14、28d时分三次取材。用RT-PCR，Western blot检测各组肺组织中HGF及TGF—β1 mRNA及蛋白的表达。结果A组28dTGF—β1的光密度值（0．693±0．028）及灰度值（0．96±0．10）最低。B组28dTGF—β1光密度值（1．586±0．020）及灰度值（1．77±0．15）最高、F组28dTGF—β1光密度值（0．881±0．032）及灰度值（1．19±0．12）与B组比较最低。而HGF的光密度值及灰度值的检测正好相反。F组28dHGF的光密度值及灰度值最高。B组与D组的HGF和TGF—β1光密度值及灰度值差异无统计学意义（P〉0．05）。结论姜黄素抑制肺纤维化的机制之一可通过增高HGF的活性同时减低TGF—β1的活性来实现，这种作用有一定的剂量依赖性。