糖尿病肾病与肝细胞核因子-1β相关基因研究

目的 :探讨河南省汉族人群中糖尿病肾病患者与肝细胞核因子 1β基因exon2、exon3是否关联。 方法 :运用聚合酶链反应 单链构像多态性技术对 9个糖尿病家系中 42例糖尿病肾病患者 ;82例 2型糖尿病患者 ;90例健康献血者进行分析。结果 :42例糖尿病肾病患者肝细胞核因子 1β基因exon2、exon3未发现异常条带。 结论 :肝细胞核因子 1β基因exon2、exon3可能不是河南省汉族人群中糖尿病肾病患者的主要致病基因片段。

人肝细胞核因子-1β基因cDNA全长的克隆与表达

目的构建人肝细胞核因子-1β(hHNF-1β)基因cD-NA全长的原核表达质粒[pET-28a(+)-hHNF-1β]并在大肠杆菌(E.Coli)中高效表达。方法提取正常成人肝脏组织的总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收,构建克隆载体pMD-HNF-1β,设计带酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,测序后IPTG诱导表达,Western blot检测其特异表达,并对重组hHNF-1β(rhH-NF-1β)诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化。结果测序证实所得的hHNF-1βcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hHNF-1β的双酶切结果与预期大小完全一致。IPTG诱导的最佳浓度是0.04 mmol/L,时间为6 h,温度为37℃。结论成功克隆和构建了hHNF-1β基因的原核表达载体并对诱导表达的条件进行了优化,为进一步的功能分析奠定基础。

肝细胞核因子-1b在糜烂性毒剂2-氯乙基乙基硫醚诱导急性肺支气管上皮细胞损伤中的作用及其机制

目的:探讨肝细胞核因子-1b(HNF-1b)在糜烂性毒剂2-氯乙基乙基硫醚(CEES)诱导人源性肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)损伤中的作用及其机制。方法:用不同浓度(0、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L)的CEES染毒BEAS-2B细胞24 h,使用CCK-8法检测细胞活力,光镜下观察细胞形态,分别采用DCFH-DA和MitoSOX荧光探针检测细胞总活性氧(ROS)和线粒体ROS水平。Western blot检测BEAS-2B细胞中HNF-1b蛋白的表达。再利用慢病毒感染技术构建过表达HNF-1b的BEAS-2B细胞系,用1 mmol/L CESS处理24 h后,分别采用CCK-8法测定细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,MitoSOX和DHE荧光探针检测线粒体ROS和细胞总ROS水平,JC-1染色法检测线粒体膜电位。结果:与对照组比较,0.6~1.2 mmol/L CEES染毒后细胞活力均降低(P<0.01);细胞形态发生损伤性改变;0.8~1.2 mmol/L CEES染毒后细胞总ROS和线粒体ROS水平均增加(P<0.01);CEES染毒组细胞HNF-1b蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。慢病毒转染后,与对照组正常细胞相比,CEES染毒组HNF-1b过表达细胞的细胞活力显著增加(P<0.01),细胞凋亡率降低(P<0.01),线粒体膜电位的损伤缓解,且线粒体ROS和细胞内总ROS水平显著降低(P<0.01)。结论:糜烂性毒剂CEES能够导致肺支气管上皮细胞中HNF-1b表达降低,过表达HNF-1b能够减轻CEES诱导的细胞损伤和凋亡,抑制线粒体功能障碍,其机制可能与抗氧化有关。上述结果提示HNF-1b可能是糜烂性毒剂导致肺损伤的新靶点,激活HNF-1b可能是糜烂性毒剂毒性靶点治疗的新策略。

中国人青年发病的成年型糖尿病/2型糖尿病家系葡萄糖激酶和肝细胞核因子-1α基因缺陷的分子筛查

目的 :探索包含青年发病的成年型糖尿病 ( maturity- onset diabetes of the young,MODY)患者的 2型糖尿病家族中可能存在的 MODY基因的致病突变。方法 :选择 MODY基因中突变率最高的葡萄糖激酶 ( glucokinase,GCK,MODY2 )和肝细胞核因子- 1α( hepatic nuclear factor- 1α,HNF- 1α,MODY3 )基因的微卫星多态遗传标志 ,在一个包含 2名 MODY患者的中国人 2型糖尿病家系中进行连锁分析 ,对可能与疾病连锁的基因进行全基因外显子的突变筛查—— DNA序列直接测定以明确具体的碱基突变和所编码的氨基酸的改变。结果 :家系 5 0 0 0 1中 MODY3的最大 L OD( logarithm of odds)值达到 2 .3 75 93 0 (θ=0 .0 0 0 0 0 0 ) ,但未发现与MODY2连锁的依据。 DNA直接测序发现在家系 5 0 0 0 1中所有家族成员 MODY3基因外显子 7中存在一个杂合多态 Ser4 87Asn( AGC/ AAC) ,该多态在正常人中也可见到。结论 :GCK基因内或附近的基因变异不是本家系 2型糖尿病的主要致病原因 ;HNF- 1α基因的启动子和所有外显子内均未发现明确的致病突变 ,但无法否定内含子或其他调节区域的变异有可能的致病倾向 ;也不能排除HNF- 1α基因附近其他未知疾病基因的致病可能。本家系的致病基因有待进一步明确。

肝细胞核因子-1α基因A1a98 Val变异与中国汉族迟发型2型糖尿病的关系

目的 :探讨肝细胞核因子 1α(HNF 1α)基因外显子 1Ala98Val变异是否与中国汉族迟发型 2型糖尿病相关。方法 :选择中国汉族 15 0例迟发型 2型糖尿病患者及 15 5例正常对照者 ,应用聚合酶链反应———限制性片段长度多态 (PCR SSCP)及直接测序法检测Ala98Val变异。结果 :受检者均不存在Ala98Val变异。结论 :Ala98Val变异不是引起中国汉族迟发型 2型糖尿病的重要遗传因素。

妊娠期糖尿病与肝细胞核因子-1aI27L基因多态性关系的研究

目的了解妊娠期糖尿病遗传易感性与HNF-la I27L单核苷酸多态性的关系。方法采用病例对照及单核苷酸多态性分析192例妊娠期糖尿病,198例对照组,并对其HNF-la I27L多态性位点进行基因分型。结果①HNF-la I27L基因型频率经Hardy-Weinberg平衡定律检验,符合遗传平衡法则,表明各基因频率满足遗传平衡(p>0.05),基因型频率分布具有群体代表性。②GDM和对照组孕妇的HNF-1aI27L II,IL基因型频率分别为38.6,48.9%和51.1,37.8%,差异有统计学意义(p<0.05)。③HNF-la I27L基因中L等位基因的频率在GDM组轻度升高(OR 1.37,95%CI 1.02～1.84)。结论 HNF-la I27L单核苷酸多态性可能与GDM遗传易感性有关;HNF-la I27L位点L等位基因可能与GDM的发生有关。

肝细胞核因子-1α（HNF-1α）基因突变致青少年发病的成人型糖尿病（MODY3）

目的青少年发病的成人型糖尿病(MODY)是一种特殊类型糖尿病(常染色体显性遗传),单基因突变为其诱因。无自身免疫或胰岛素抵抗的相关证据,有β细胞功能缺陷,发病年龄早是其基本特征。目前已发现的MODY致病基因有14种,其中肝细胞核因子-1α(HNF-1α)基因突变是MODY3的致病基因。在已确诊为糖尿病的人群中估计有1%~2%的患者是MODY3,该病的临床表现有较大异质性,易被误诊为T1DM或T2DM。磺脲类药物是MODY3患者的一线用药,该病的最终确诊有赖于基因检测。正确的分子诊断有利于MODY患者家系成员的风险评估、预后判断、治疗方案选择。

肝细胞核因子-1α基因多态性与血浆胰岛素水平的变化

目的 了解２型糖尿病中肝细胞核因子（ＨＮＦ）－１α基因的变化与其对血浆胰岛素水平的影响。方法 用梯度变性胶电泳分析２型糖尿病与正常人的ＨＮＦ－１α基因改变，测定相应血浆胰岛素水平，统计分析它们之间的关系。结果 发现该基因三处多态性改变；第７号外显子中密码子４５９的ＣＴＧ变为ＴＴＧ，密码子４８９的ＡＧＣ变为ＡＡＣ，第７号内含子第７位碱基Ｇ变为Ａ，这三处变化为一种多态性。多态性纯合子的血浆胰岛素水平偏低，在７５ｇ葡萄糖负荷后血浆胰岛素水平与正常基因型的进行ｔ检验，Ｐ＜０．０５。结论 携带上述多态性改变者胰岛素分泌水平偏低，提示ＨＮＦ－１α的这一多态性改变可能在２型糖尿病发病中起一定的作用。

Sirt1通过HNF-1α/FXR-1通路调控脓毒症肝损伤的动物研究

目的:探讨沉默信息调节因子1(Sirtuin 1,Sirt1)在脓毒症肝损伤中的作用及机制。方法:采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)法构建脓毒症小鼠模型,并设置腹腔注射生理盐水小鼠作为对照组,用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)检测脓毒症小鼠模型的肝损伤情况,采用定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qrt-PCR)检测脓毒症小鼠及对照组小鼠肝组织中的Sirt1/肝细胞核因子-1α(hepatic nuclear factor-1α,HNF-1α)/法尼酯X受体1(farnesoid X receptor-1,FXR-1)通路表达情况。分离鉴定原代小鼠肝实质细胞,采用CCK8法检测不同质量浓度的LPS对小鼠肝实质细胞活力的影响;利用细胞增殖成像分析试剂盒(EdU法)检测不同质量浓度的LPS对小鼠肝实质细胞增殖能力的影响;应用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测不同质量浓度的LPS对小鼠肝实质细胞炎症因子[白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)/肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]分泌的影响。构建过表达Sirt1质粒,然后以Lipofectamine2000为载体,转染进细胞,48 h后采用qrt-PCR检测Sirt1/HNF-1α/FXR-1通路的表达情况,分别采用CCK8、EdU法以及ELISA法检测Sirt1对LPS在肝实质细胞中功能的影响。结果:与对照组相比,LPS诱导的脓毒症小鼠肝损伤样本中Sirt1/HNF-1α/FXR-1通路表达下调;LPS会降低小鼠肝实质细胞的活力,抑制肝实质细胞的增殖能力,并促进肝实质细胞中炎症因子IL-6及TNF-α的分泌。转染过表达Sirt1的肝实质细胞中,HNF-1α/FXR-1通路的表达上调,且能够抑制LPS引起的细胞活力及增殖降低以及炎症因子的分泌。结论:Sirt1/HNF-1α/FXR-1通路参与调控LPS诱导的脓毒症肝损伤,过表达Sirt1能够抑制LPS在肝实质细胞中的损伤效应。

GCK基因和HNF-1α基因突变的研究

目的:研究一典型的青少年发病的成人型糖尿病家系并研究其基因突变位点。方法:以1个典型MODY家系的7名成员为研究对象,同时以10名无糖尿病家族史的普通2型糖尿病患者和10名健康人员为2个对照组。抽取外周血,分离白细胞,用快速盐析法提取基因组DNA,以基因组DNA为模板对HNF-1α基因的4号、2号和6号外显子和GCK基因的1号外显子进行PCR扩增,扩增产物经纯化后直接进行序列测定,并分别和各自的正常序列进行比较。结果:7名MODY家系成员HNF-1α2号外显子上游的内含子均存在一碱基G→A置换,即IVS2nt-42 G-A;4例存在HNF-1α6号外显子P380fsinsG移码突变,其中1例合并P379S点突变和IVS6nt-4G-A突变;1例存在P379S点突变;2例未发现突变和多态性。GCK基因的1号外显子及其内含子均未发现有突变或多态性。20名对照组成员均未发现有GCK1号外显子和HNF-1α2、4、6号外显子及其内含子的突变。结论:本家系是HNF-1α基因的6号外显子及其上游内含子突变(移码突变和/或点突变)和2号外显子上游内含子的一个碱基突变,该家系MODY属于MODY3。

肝细胞核因子-1α基因突变协同腺瘤样结肠息肉病基因突变对家族性腺瘤性息肉病细胞增殖的影响

目的探讨肝细胞核因子-1α(HNF-1α)基因突变协同腺瘤样结肠息肉病基因(APC)突变对家族性腺瘤性息肉病(FAP)细胞增殖的影响。方法利用RNA干扰技术,构建HNF-1α基因突变协同APC突变细胞模型,通过MTT法、克隆形成、划痕试验、细胞迁移、细胞侵袭及致瘤等实验观察HNF-1α基因突变协同APC突变对FAP细胞的增殖能力。结果与单突变组比较,HNF-1α基因突变协同APC突变组FAP细胞具有较强的细胞克隆形成、细胞迁移、细胞侵袭及致瘤性。结论HNF-1α基因协同APC突变促进了FAP细胞增殖。

胃肠胰神经内分泌肿瘤组织lncRNA HNF1A-AS1表达变化及其与患者预后的关系

目的观察胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NENs)组织长链非编码RNA(lncRNA)肝细胞核因子1α-反义链1(HNF1A-AS1)表达变化,并分析其表达与患者预后的关系。方法选择GEP-NENs患者85例,取手术切除的GEP-NENs组织及其配对的癌旁正常组织,采用RT-qPCR技术检测lncRNA HNF1A-AS1表达。比较GEP-NENs组织与癌旁正常组织lncRNA HNF1A-AS1表达差异,并分析lncRNA HNF1A-AS1表达与GEP-NENs患者临床病理特征的关系。以GEP-NENs组织lncRNA HNF1A-AS1相对表达量的均数为截断值,将患者分为lncRNA HNF1A-AS1高表达者与lncRNA HNF1A-AS1低表达者,比较不同lncRNA HNF1A-AS1表达的GEP-NENs患者3年累积生存率差异。采用Cox比例风险回归模型分析GEP-NENs患者预后不良的危险因素。结果 GEP-NENs组织lncRNA HNF1A-AS1相对表达量明显低于癌旁正常组织(P <0.01)。lncRNA HNF1A-AS1表达与TNM分期、浸润深度、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位无关(P均> 0.05)。lncRNA HNF1A-AS1高表达者41例、lncRNA HNF1A-AS1低表达者44例,lncRNA HNF1A-AS1高表达者3年累积生存率明显高于lncRNA HNF1A-AS1低表达者(P <0.01)。多因素Cox比例风险回归分析显示,TNM分期Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴结转移是GEPNENs患者预后不良的危险因素,而lncRNA HNF1A-AS1高表达是其保护因素(P均<0.05)。结论 GEP-NENs组织lncRNA HNF1A-AS1低表达,其表达变化与TNM分期、浸润深度和淋巴结转移有关;lncRNA HNF1A-AS1高表达是GEP-NENs患者预后的保护因素。

一个新的肝细胞核因子1α仪基因突变致青少年的成人起病型糖尿病3型家系报道

目的探讨一个青少年的成人起病型糖尿病（MODY）家系的致病基因。方法对一例发病9年的32岁女性糖尿病患者家系成员进行调查，该家系中有两代糖尿病患者，采用目标区域捕获高深度测序技术在先证者中找到突变基因，使用Sanger测序技术验证突变位点并筛查其他家系成员。结果基因检测发现家系中3个个体携带肝细胞核因子1仅（HNF·1α）基因V380Cfs。39移码突变，该突变在家系中表现为与糖尿病共分离。结论该家系为一个新的HNF-1α仅基因突变所致MODY3家系。

ER、HNF-1β及COX-2在子宫内膜异位相关性卵巢癌中的表达及临床意义

目的探究雌激素受体(ER)、肝细胞核因子-1β(HNF-1β)以及环氧化酶-2(COX-2)在不同类型子宫内膜异位相关性卵巢癌(EAOC)中的表达差异。方法选取2011年7月至2016年4月苏州大学附属第二医院收治的EAOC患者44例,其中子宫内膜样癌17例,透明细胞癌21例,卵巢浆液性癌6例。采用免疫组织化学法检测ER、HNF-1β及COX-2在不同类型EAOC中的表达差异,并采用Spearman秩相关分析探讨三者表达水平的相关性。结果ER在子宫内膜样癌患者中的阳性率为100.0%,显著高于透明细胞癌患者的9.5%和卵巢浆液性癌患者的0%(χ~2=4.305,P<0.01),而HNF-1β在透明细胞癌和卵巢浆液性癌患者中的阳性率分别为85.7%和100.0%,显著高于子宫内膜样癌患者的11.8%(χ~2=3.585,P<0.01),COX-2在子宫内膜样癌、透明细胞癌和卵巢浆液性癌患者中的阳性率分别76.5%、81.0%、83.3%,差异无统计学意义(χ~2=0.744,P=0.104)。ER和HNF-1β的表达水平呈负相关(r=-0.428,P<0.01),与COX-2的表达水平呈正相关(r=0.204,P=0.013)。结论 ER主要在子宫内膜样癌中表达,HNF-1β主要在透明细胞癌和卵巢浆液性癌中表达,ER的表达水平与HNF-1β及COX-2的表达水平具有一定的相关性。

平胃散对糖脂代谢紊乱小鼠血脂血糖和HNF-1β表达的影响

目的：观察平胃散对高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱小鼠血脂、血糖和肝细胞核因子-1β（hepatocyte nuclear factor-1β,HNF-1β/TCF2）表达的影响,探讨平胃散调节糖脂代谢可能存在的分子机制。方法：40只SPF级C57BL/6J成年雄性小鼠随机分为正常组（n=8）和造模组（n=32）,分别以普通饲料和高脂饲料喂养10周。第11周起,将造模组随机分为模型组,平胃散组（6 g·kg^-1·d^-1）,二甲双胍组（300 mg·kg^-1·d^-1）和辛伐他汀组（2 mg·kg^-1·d^-1）,每组8只。正常组及模型组只给予相同体积蒸馏水,即各组灌胃10 m L·kg^-1·d^-1,通过药物干预4周。喂养期间对体质量、腹围、血脂、血糖和胰岛素进行连续监测。干预结束后取肝脏和肾脏组织检测HNF-1β的mRNA和蛋白表达。结果：第10周末,与正常组比较,造模组体质量,腹围,胆固醇（TC）,甘油三酯（TG）,低密度脂蛋白（LDL-C）,高密度脂蛋白（HDL-C）和空腹血糖（FPG）均明显升高（P〈0.05）,空腹胰岛素（FINS）明显降低（P〈0.05）。用药4周后,与正常组比较,模型组体质量、腹围、血脂和口服葡萄糖耐量试验（OGTT）4个时间段血糖均显著升高（P〈0.01）,FINS,HNF-1β的mRNA和蛋白相对表达量均降低（P〈0.05）。与模型组比较,平胃散组体质量,腹围,TC,TG和OGTT 4个时间段血糖均降低（P〈0.05）,FINS,HNF-1β的mRNA和蛋白相对表达量均升高（P〈0.05）,二甲双胍组体质量,腹围,TC,TG,LDL-C,OGTT 4个时间段血糖均降低（P〈0.05）,FINS,HNF-1β的mRNA和蛋白相对表达量均升高（P〈0.05）,辛伐他汀组体质量、腹围、血脂均显著降低（P〈0.01）,FINS,HNF-1β的mRNA和蛋白相对表达量均升高（P〈0.05）。结论：高脂饮食喂养10周即可建立良好的糖脂代谢紊乱小鼠模型,平胃散可能通过调节HNF-1β的表达来调节血脂和血糖水平。

青少年的成人起病型糖尿病3型一例

患者,女,34岁,汉族,因“发现血糖升高15年,视力下降3月余”入院。患者15年前因“带状疱疹”于外院就诊时查随机血糖高达20.6 mmol/L,尿糖(++++),尿酮体(-)。行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)确诊为“糖尿病”,未明确分型。予诺和灵30R 12~16 U/日降糖治疗,空腹血糖控制在5~6 mmol/L,餐后2小时血糖7~10 mmol/L。5年前因妊娠将降糖方案调整为门冬胰岛素联合地特胰岛素治疗,产后再次调整为诺和灵30R,血糖控制欠佳。近3个多月前出现视力下降,血糖控制不佳,遂来我院就诊。患者否认乙肝、结核传染病史,无高血压、心脏病慢性病史,无手术、外伤史,对“青霉素”过敏。出生于本地,无疫区接触史。月经史:初潮13岁,平素月经周期规律。

烟酸对HepG2细胞载脂蛋白M表达的影响及其机制

目的:探讨烟酸对HepG2细胞载脂蛋白M表达的影响及其机制。方法:分别以不同浓度的烟酸(0、0.25、0.5、1.0、2.0mmol/L)干预HepG2细胞24h。提取各组细胞总RNA和蛋白质,分别采用实时R T-PCR和Western Blot检测载脂蛋白M的mRNA和蛋白的表达。采用实时R T-PCR检测肝细胞核因子-1αmRNA的表达。结果:烟酸呈剂量依赖性上调载脂蛋白M基因和蛋白、肝细胞核因子-1α基因的表达(P<0.05)。结论:烟酸可上调载脂蛋白M表达,其机制可能是通过上调肝细胞核因子-1α来实现的。