大麻二酚对转化生长因子β1诱导肝星状细胞活化和肝纤维化的作用

背景:大麻二酚具有抗炎、抗氧化等药理学作用,并且不具有精神活性,在肝脏疾病中的研究日渐增加,但其对肝星状细胞转化生长因子β1/Smad信号转导通路的作用尚未明确。目的:探讨大麻二酚对肝星状细胞中转化生长因子β1/Smad信号转导通路的影响,研究其抗肝纤维化的可能机制。方法:(1)体外实验:选取大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),分6组培养:对照组常规培养24 h,单纯药物组加入大麻二酚培养24 h,造模组加入转化生长因子β1培养24 h,造模+低剂量药物组、造模+高剂量药物组、造模+阳性对照组均加入转化生长因子β1培养24 h后分别加入1,5μmol/L大麻二酚或水飞蓟素培养24 h。培养结束后,检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白与Ⅰ型胶原mRNA表达、白细胞介素1β与肿瘤坏死因子α水平及Ⅰ型胶原、转化生长因子β1/Smad信号转导通路蛋白表达。(2)动物体内实验:将C57BL/6J小鼠随机分为5组,每组8只:假手术组不造模,造模组、造模+低剂量药物组、造模+高剂量药物组、造模+阳性对照组通过胆管结扎法建立肝纤维化模型,造模3周后分别腹腔注射4,8 mg/kg大麻二酚或水飞蓟素,1次/d,连续给药7 d。给药结束后,检测各组小鼠肝功能、肝脏病理形态及α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、转化生长因子β1/Smad信号转导通路相关蛋白表达。结果与结论:(1)体外实验:与对照组比较,造模组HSC-T6细胞α-平滑肌肌动蛋白与Ⅰ型胶原mRNA表达、白细胞介素1β与肿瘤坏死因子α水平以及Ⅰ型胶原、转化生长因子β1、p-Smad2/3蛋白表达均升高(P<0.05),Smad7蛋白表达降低(P<0.05);两种剂量大麻二酚处理可改善转化生长因子β1诱导的HSC-T6细胞上述指标的变化,并且以造模+高剂量药物组改善作用更明显;(2)体内实验:与假手术组比较,模型组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶活性升高(P<0.05),肝组织中炎性细胞浸润及胶原含量增加(P<0.05),转化生长因子β1/Smad信号转导通路被激活,α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白表达升高(P<0.05);两种剂量大麻二酚干预可减轻造模小鼠上述指标的变化,并且以造模+高剂量药物组效果更明显;(3)结果表明,大麻二酚通过抑制肝星状细胞转化生长因子β1/Smad信号传导通路的激活抑制肝纤维化。

肝细胞核因子-1b在糜烂性毒剂2-氯乙基乙基硫醚诱导急性肺支气管上皮细胞损伤中的作用及其机制

目的:探讨肝细胞核因子-1b(HNF-1b)在糜烂性毒剂2-氯乙基乙基硫醚(CEES)诱导人源性肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)损伤中的作用及其机制。方法:用不同浓度(0、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L)的CEES染毒BEAS-2B细胞24 h,使用CCK-8法检测细胞活力,光镜下观察细胞形态,分别采用DCFH-DA和MitoSOX荧光探针检测细胞总活性氧(ROS)和线粒体ROS水平。Western blot检测BEAS-2B细胞中HNF-1b蛋白的表达。再利用慢病毒感染技术构建过表达HNF-1b的BEAS-2B细胞系,用1 mmol/L CESS处理24 h后,分别采用CCK-8法测定细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,MitoSOX和DHE荧光探针检测线粒体ROS和细胞总ROS水平,JC-1染色法检测线粒体膜电位。结果:与对照组比较,0.6~1.2 mmol/L CEES染毒后细胞活力均降低(P<0.01);细胞形态发生损伤性改变;0.8~1.2 mmol/L CEES染毒后细胞总ROS和线粒体ROS水平均增加(P<0.01);CEES染毒组细胞HNF-1b蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。慢病毒转染后,与对照组正常细胞相比,CEES染毒组HNF-1b过表达细胞的细胞活力显著增加(P<0.01),细胞凋亡率降低(P<0.01),线粒体膜电位的损伤缓解,且线粒体ROS和细胞内总ROS水平显著降低(P<0.01)。结论:糜烂性毒剂CEES能够导致肺支气管上皮细胞中HNF-1b表达降低,过表达HNF-1b能够减轻CEES诱导的细胞损伤和凋亡,抑制线粒体功能障碍,其机制可能与抗氧化有关。上述结果提示HNF-1b可能是糜烂性毒剂导致肺损伤的新靶点,激活HNF-1b可能是糜烂性毒剂毒性靶点治疗的新策略。

肝细胞核因子-1α（HNF-1α）基因突变致青少年发病的成人型糖尿病（MODY3）

目的青少年发病的成人型糖尿病(MODY)是一种特殊类型糖尿病(常染色体显性遗传),单基因突变为其诱因。无自身免疫或胰岛素抵抗的相关证据,有β细胞功能缺陷,发病年龄早是其基本特征。目前已发现的MODY致病基因有14种,其中肝细胞核因子-1α(HNF-1α)基因突变是MODY3的致病基因。在已确诊为糖尿病的人群中估计有1%~2%的患者是MODY3,该病的临床表现有较大异质性,易被误诊为T1DM或T2DM。磺脲类药物是MODY3患者的一线用药,该病的最终确诊有赖于基因检测。正确的分子诊断有利于MODY患者家系成员的风险评估、预后判断、治疗方案选择。

原发性肝癌患者TACE术后Th1/Th2细胞因子、VEGFR水平变化及其临床意义

目的探究原发性肝癌患者经肝动脉插管化疗栓塞术(TACE)治疗后Th1/Th2细胞因子、血管内皮生长因子受体(VEGFR)水平变化及其临床意义。方法选取接受TACE术治疗的原发性肝癌患者92例,根据治疗效果将完全缓解、部分缓解者纳入有效组(n=50),将疾病进展、疾病稳定者纳入无效组(n=42)。比较2组患者的一般临床资料及术前、术后血清Th1/Th2细胞因子水平[白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-18(IL-18)]、VEGFR水平变化,采用Logistic回归模型进行分析上述指标与疗效的相关性,并通过ROC曲线预测分析上述指标术后水平对疗效的预测效能,比较各指标术后不同水平患者的无进展生存期差异。结果术后2组患者的IL-2、IL-4和VEGFR均较术前下降,且有效组显著低于无效组(P<0.05);术后2组患者的IL-18均较术前显著上升,且有效组显著高于无效组(P<0.05)。IL-2、IL-4、IL-18和VEGFR均与临床疗效具有显著相关性(P<0.05),ROC曲线显示,IL-2、IL-18、VEGFR的AUC值均有评估价值(P<0.05),而IL-4的ROC曲线AUC值评估价值不高(P>0.05)。IL-2、VEGFR高水平患者平均无进展生存期显著短于IL-2、VEGFR低水平患者(P<0.05),IL-18低水平患者无进展生存期显著短于IL-18高水平患者(P<0.05)。结论原发性肝癌患者在TACE术后Th1/Th2细胞因子免疫平衡得以纠正,VEGFR水平表现出下降,其中血清IL-2与VEGFR水平均与疗效及生存期密切相关,可在临床疗效及预后评估中提供参考。

缺氧诱导因子1α在肝细胞癌靶点治疗中的研究进展

肝细胞癌(HCC)关键基因和调控分子为靶点的新型治疗方案逐步在临床中开展。缺氧诱导因子(HIF)作为肝癌细胞适应缺氧微环境的关键因子,其介导改变了许多基因的转录。HIF拥有广泛的靶基因,可通过调控各种信号通路促使癌细胞发生代谢重编程、血管生成、侵袭转移、免疫逃逸等。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)作为HIF家族的主要成员,可为HCC的治疗挖掘潜在靶点提供新思路和新见解。

肝细胞癌中载脂蛋白M,肝受体同系物1和肝细胞核因子1α表达的相关性分析

目的:探讨肝细胞癌(HCC)组织和癌旁组织中载脂蛋白M(apoM)、肝受体同系物1(LRH-1)和肝细胞核因子1α(HNF-1α)的表达并分析3者之间的相关性。方法:采用RT-PCR和免疫组化分别检测17例原发性肝细胞癌和相应癌旁组织中apoM、LRH-1、HNF-1αmRNA的表达及apoM和HNF-1α蛋白的表达。结果:apoM、LRH-1和HNF-1αmRNA及apoM和HNF-1α蛋白在癌组织中的表达均明显高于癌旁组织(P均<0.01)。LRH-1、HNF-1αmRNA和apoMmRNA表达均呈正相关关系(依次为r=0.463,P<0.01;r=0.356,P<0.05)。结论:肝细胞癌中apoM的表达和LRH-1及HNF-1α表达密切相关,LRH-1和HNF-1α可能是apoM表达的重要调节因子。

中国人青年发病的成年型糖尿病/2型糖尿病家系葡萄糖激酶和肝细胞核因子-1α基因缺陷的分子筛查

目的 :探索包含青年发病的成年型糖尿病 ( maturity- onset diabetes of the young,MODY)患者的 2型糖尿病家族中可能存在的 MODY基因的致病突变。方法 :选择 MODY基因中突变率最高的葡萄糖激酶 ( glucokinase,GCK,MODY2 )和肝细胞核因子- 1α( hepatic nuclear factor- 1α,HNF- 1α,MODY3 )基因的微卫星多态遗传标志 ,在一个包含 2名 MODY患者的中国人 2型糖尿病家系中进行连锁分析 ,对可能与疾病连锁的基因进行全基因外显子的突变筛查—— DNA序列直接测定以明确具体的碱基突变和所编码的氨基酸的改变。结果 :家系 5 0 0 0 1中 MODY3的最大 L OD( logarithm of odds)值达到 2 .3 75 93 0 (θ=0 .0 0 0 0 0 0 ) ,但未发现与MODY2连锁的依据。 DNA直接测序发现在家系 5 0 0 0 1中所有家族成员 MODY3基因外显子 7中存在一个杂合多态 Ser4 87Asn( AGC/ AAC) ,该多态在正常人中也可见到。结论 :GCK基因内或附近的基因变异不是本家系 2型糖尿病的主要致病原因 ;HNF- 1α基因的启动子和所有外显子内均未发现明确的致病突变 ,但无法否定内含子或其他调节区域的变异有可能的致病倾向 ;也不能排除HNF- 1α基因附近其他未知疾病基因的致病可能。本家系的致病基因有待进一步明确。

妊娠期糖尿病肝细胞核因子1a外显子7基因多态性与血浆胰岛素水平的相关性

目的了解妊娠期糖尿病孕妇肝细胞核因子1a外显子7基因变异与血浆胰岛素水平的相关性。方法分析妊娠期糖尿病与正常人的肝细胞核因子1a外显子7基因变异,测定相应血浆胰岛素水平,统计分析它们之间的关系。结果妊娠期糖尿病孕妇肝细胞核因子1a第7号外显子中密码子459的CTG变为CTA,CTG变为TTG,密码子487位AGC变为AAC。这变化为一种多态性。多态性纯合子的血浆胰岛素水平偏低。结论肝细胞核因子1a外显子7基因多态性纯合子孕妇胰岛素分泌水平偏低,提示HNF-1a外显子7基因的多态性改变可能与妊娠期糖尿病的发病有关系。

肝细胞核因子1α基因多态位点与上海地区2型糖尿病相关临床性状的关系

目的肝细胞核因子(HNF)-1α基因单核苷酸多态(SNP)位点可能与2型糖尿病及其相关性状相关,对以往发现的HNF-1α基因6个标签SNP进行糖尿病相关数量性状分析,以进一步探讨其与糖脂代谢及体脂分布的潜在关系。方法245名无亲缘关系的上海地区中国人,包括152例早发/多发糖尿病家系先证者(病例组)及93名糖调节正常者(正常对照组)。采用直接测序或聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)方法检测受试者基因型,并测定所选人群的糖脂代谢及体脂分布指标。对不同基因型亚组间进行标签SNP的单点和单倍型数量性状分析。结果正常对照组中,rs1169294、rs1169301和rs2259820的各基因型亚组间的体质指数(BMI)、腰臀比(WHR)和腰股比(WFR)的差异均有统计学意义(P值均<0.05),且经性别、年龄校正后差异仍有统计学意义(P值均<0.05)。此外,rs1169289的基因型亚组间WFR的差异有统计学意义(P<0.05)。单倍型分析发现,正常对照组中最常见单倍型GCGC携带者的BMI较非GCGC携带者显著降低(P=0.006 5),且经年龄和性别校正后,差异仍有统计学意义(P=0.017 0)。结论HNF-1α多态位点与中国人体脂分布相关。

肝细胞核因子-1α基因A1a98 Val变异与中国汉族迟发型2型糖尿病的关系

目的 :探讨肝细胞核因子 1α(HNF 1α)基因外显子 1Ala98Val变异是否与中国汉族迟发型 2型糖尿病相关。方法 :选择中国汉族 15 0例迟发型 2型糖尿病患者及 15 5例正常对照者 ,应用聚合酶链反应———限制性片段长度多态 (PCR SSCP)及直接测序法检测Ala98Val变异。结果 :受检者均不存在Ala98Val变异。结论 :Ala98Val变异不是引起中国汉族迟发型 2型糖尿病的重要遗传因素。

妊娠期糖尿病与肝细胞核因子-1aI27L基因多态性关系的研究

目的了解妊娠期糖尿病遗传易感性与HNF-la I27L单核苷酸多态性的关系。方法采用病例对照及单核苷酸多态性分析192例妊娠期糖尿病,198例对照组,并对其HNF-la I27L多态性位点进行基因分型。结果①HNF-la I27L基因型频率经Hardy-Weinberg平衡定律检验,符合遗传平衡法则,表明各基因频率满足遗传平衡(p>0.05),基因型频率分布具有群体代表性。②GDM和对照组孕妇的HNF-1aI27L II,IL基因型频率分别为38.6,48.9%和51.1,37.8%,差异有统计学意义(p<0.05)。③HNF-la I27L基因中L等位基因的频率在GDM组轻度升高(OR 1.37,95%CI 1.02～1.84)。结论 HNF-la I27L单核苷酸多态性可能与GDM遗传易感性有关;HNF-la I27L位点L等位基因可能与GDM的发生有关。

糖尿病肾病与肝细胞核因子-1β相关基因研究

目的 :探讨河南省汉族人群中糖尿病肾病患者与肝细胞核因子 1β基因exon2、exon3是否关联。 方法 :运用聚合酶链反应 单链构像多态性技术对 9个糖尿病家系中 42例糖尿病肾病患者 ;82例 2型糖尿病患者 ;90例健康献血者进行分析。结果 :42例糖尿病肾病患者肝细胞核因子 1β基因exon2、exon3未发现异常条带。 结论 :肝细胞核因子 1β基因exon2、exon3可能不是河南省汉族人群中糖尿病肾病患者的主要致病基因片段。

人肝细胞核因子-1β基因cDNA全长的克隆与表达

目的构建人肝细胞核因子-1β(hHNF-1β)基因cD-NA全长的原核表达质粒[pET-28a(+)-hHNF-1β]并在大肠杆菌(E.Coli)中高效表达。方法提取正常成人肝脏组织的总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收,构建克隆载体pMD-HNF-1β,设计带酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,测序后IPTG诱导表达,Western blot检测其特异表达,并对重组hHNF-1β(rhH-NF-1β)诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化。结果测序证实所得的hHNF-1βcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hHNF-1β的双酶切结果与预期大小完全一致。IPTG诱导的最佳浓度是0.04 mmol/L,时间为6 h,温度为37℃。结论成功克隆和构建了hHNF-1β基因的原核表达载体并对诱导表达的条件进行了优化,为进一步的功能分析奠定基础。

α_(1A)-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2稳定共表达细胞的构建

目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^(-1)压力筛选后加入α_(1A)-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10μmol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到稳定表达α_(1A)-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α_(1A)-AR mRNA和蛋白的表达水平。③将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10^(-8)~10^(-5) mol·L^(-1))或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10^^(-8.8)~10^(-5) mol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位。④将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1μmol·L^(-1))组、NE(1μmol·L^(-1))组、萘派地尔+NE(各1μmol·L^(-1)共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1μmol·L^(-1))组、DMED(0.1μmol·L^(-1))组、阿替美唑+DMED(各0.1μmol·L^(-1)共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1μmol·L^(-1)与DMED 0.1μmol·L^(-1)共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α_(1A)-AR功能的特异性。结果①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞,NE 10μmol·L^(-1)孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α_(1A)-AR和EGFPNFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞可明显表达α_(1A)-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α_(1A)-AR蛋白表达。RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5~20代内α_(1A)-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500~800倍。③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数有效浓度(EC50)分别为5.94×10^(-7)和6.15×10^(-8) mol·L^(-1)。④与溶剂对照组和萘派地尔组比较,NE组U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),而萘派地尔+NE组EGFP-NFAT2核转位较NE组明显减弱(P<0.01)。与溶剂对照组和阿替美唑组比较,DMED组EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),阿替美唑+DMED组EGFP-NFAT2核转位与DMED组比较无明显差别,而萘派地尔+DMED组EGFP-NFAT2核转位较DMED组明显减弱(P<0.01)。结论成功构建稳定共表达α_(1A)-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFPNFAT2-α_(1A)-AR细胞,可用于靶向α_(1A)-AR化合物筛选和受体分子机制研究。

河南省汉族糖尿病肾病患者肝细胞核因子-1β基因exon2测定

目的 :探讨河南省汉族人群中家族性糖尿病肾病与肝细胞核因子 - 1β(HNF - 1β)基因exon2是否关联。方法 :运用聚合酶链反应 -单链构象多态性技术 (PCR -SSCP)检测 2型糖尿病患者 6 2例 ,健康献血者 82例 ,11个糖尿病家系中 5 6例糖尿病肾病患者的HNF - 1β基因exon2片段。 结果 :糖尿病肾病患者、2型糖尿病患者、健康献血者均未发现有HNF - 1β基因exon2异常条带。 结论 :HNF -

肝细胞核因子-1α基因多态性与血浆胰岛素水平的变化

目的 了解２型糖尿病中肝细胞核因子（ＨＮＦ）－１α基因的变化与其对血浆胰岛素水平的影响。方法 用梯度变性胶电泳分析２型糖尿病与正常人的ＨＮＦ－１α基因改变，测定相应血浆胰岛素水平，统计分析它们之间的关系。结果 发现该基因三处多态性改变；第７号外显子中密码子４５９的ＣＴＧ变为ＴＴＧ，密码子４８９的ＡＧＣ变为ＡＡＣ，第７号内含子第７位碱基Ｇ变为Ａ，这三处变化为一种多态性。多态性纯合子的血浆胰岛素水平偏低，在７５ｇ葡萄糖负荷后血浆胰岛素水平与正常基因型的进行ｔ检验，Ｐ＜０．０５。结论 携带上述多态性改变者胰岛素分泌水平偏低，提示ＨＮＦ－１α的这一多态性改变可能在２型糖尿病发病中起一定的作用。

血管性血友病因子、肾损伤分子-1、肝细胞生长因子在急性肾损伤患者中的表达及与预后相关性

目的:分析血管性血友病因子(vWF)、肾损伤分子-1(KIM-1)、肝细胞生长因子(HGF)在急性肾损伤患者中的表达及与预后相关性。方法:选取2020年01月—2022年12月我院收治的125例急性肾损伤患者为研究对象,作为研究组,另外选取70例健康无疾病的体检者作为对照组。观察各组vWF、KIM-1、HGF水平,分析与预后的相关性。结果:与对照组相比,研究组APACHEⅡ评分、SOFA评分较高(P<0.05)。与Ⅰ期患者相比,Ⅱ期、Ⅲ期患者vWF、KIM-1、HGF表达水平逐渐升高(P<0.05)。与存活患者相比,死亡患者vWF、KIM-1、HGF表达水平较高(P<0.05)。vWF、KIM-1、HGF与预后呈正相关(P<0.05)。Logistic回归分析显示,肺部感染、APACHEⅡ评分、SOFA评分、氧合指数、Scr、BUN、eGFR、动脉血乳酸、vWF、KIM-1、HGF为影响急性肾损伤患者预后的危险因素。结论:vWF、KIM-1、HGF在急性肾损伤患者体内表达水平较高,且随着病情严重程度的增加,KIM-1、HGF水平逐渐升高,KIM-1、HGF与不良预后呈正相关,为急性肾损伤的危险因素。