基于3D肝细胞模型评价盐酸胺碘酮重复给药肝毒性

目的:建立3D肝细胞微球模型并用于评价盐酸胺碘酮及联用肝药酶诱导剂利福平或抑制剂酮康唑时的重复给药肝毒性。方法:采用诱导分化的HepaRG和HHSteC细胞混合共培养构建3D肝细胞微球模型,对HepaRG诱导分化后形成的胆管结构功能进行验证,活细胞探针标记肝细胞微球中两种细胞并对其分布情况进行检测,免疫荧光染色对肝细胞微球表达的特异性和功能性蛋白进行检验,并对试验周期内模型的肝功能指标稳定性进行连续监测。模型验证后,对每40个肝细胞微球进行连续4或5天的盐酸胺碘酮重复染毒,并联用肝药酶诱导剂利福平或抑制剂胺碘酮进行重复染毒,检测不同给药组的细胞毒性及肝功能指标。结果:本研究构建的3D肝细胞模型可以模拟肝脏胆管结构的外排功能,HepaRG和HHSteC细胞在微球中以24∶1的比例始终保持较均匀的分布,肝脏特异性和功能性蛋白表达丰富,并能在至少5天内维持肝功能指标稳定。在重复给予胺碘酮时,模型从给药第三天起出现剂量和时间依赖性的细胞毒性作用,且联用利福平(LDH和TBIL升高)或酮康唑(LDH、ALT、ALP和GLU升高)能产生剂量相关的肝毒性协同作用。结论:本研究成功构建更适用于短期重复给药毒性评价的3D肝细胞微球模型,对于体外药物肝毒性筛选和代谢研究具有明显优势,能够进行药物肝毒性标志物的筛选研究。

人参皂苷Rb3通过上调Klf16/Nrf2表达改善小鼠脂性肝细胞模型的脂质沉积与氧化应激

目的探讨人参皂苷Rb3对小鼠脂性肝细胞模型脂质沉积和氧化应激的影响。方法采用原位二步灌流法提取小鼠肝原代细胞,以油酸(OA)和棕榈酸(PA)混合培养基制备脂性肝细胞模型,并以人参皂苷Rb3低、中、高剂量(5、10、20 nmol·L^(-1))分别干预24 h。测定各组细胞中甘油三酯(TG)的含量;分别采用荧光探针BODIPY 493/503、BODIPY 581/591、DCFH-DA检测各组细胞脂质蓄积、脂质过氧化情况及活性氧(ROS)水平;采用qPCR法检测细胞Klf16、Nrf2 mRNA表达水平;Western Blot法检测细胞Klf16、Nrf2、Sod2蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组细胞中的TG含量显著升高(P<0.01),脂质蓄积和过氧化水平显著增强(P<0.05),ROS水平显著升高(P<0.01),Klf16、Nrf2 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),Klf16、Nrf2及Sod2蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,人参皂苷Rb3高剂量组细胞中的TG含量明显降低(P<0.01),细胞脂质蓄积、过氧化水平明显降低(P<0.05),ROS水平显著降低(P<0.01),Klf16、Nrf2 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),Klf16、Nrf2及Sod2蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论人参皂苷Rb3可一定程度改善小鼠脂性肝细胞模型的脂质蓄积和氧化应激反应,其作用机制可能与上调Klf16/Nrf2表达有关。

仿真人肝细胞模型有助于射频消融治疗肝细胞癌的研究

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，危害性大，疗效差。其现代治疗原则已从以手术切除为主的综合治疗发展为多学科参与、多技术应用、多阶段序贯的综合治疗模式。

葱白提取物对脂肪变性肝细胞模型PPAR-α及PGC-1表达的影响

目的:观察葱白提取物对脂肪变性肝细胞模型中PPAR-α及PGC-1表达的影响,探讨其防治脂肪肝的作用机制。方法:建立游离脂肪酸诱导的细胞脂肪变性模型。用不同浓度葱白提取物进行干预24h后,MTT检测的细胞活性;油红O染色观察细胞内的脂滴;生化细胞内TG、ALT、AST含量;RT-PCR和Western Blotting分别检测细胞内PPAR-α、PGC-1基因的mRNA和蛋白表达。结果:游离脂肪酸诱导24h后,油红O染色显示脂肪变性;模型组TG含量较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);各组转氨酶没有明显变化;同时胞内PPAR-α、PGC-1的mRNA、蛋白表达降低。而葱白提取物各剂量组胞内的TG较模型组显著降低,差异有统计学意(P<0.05,P<0.01),并且胞内PPAR-α、PGC-1的mRNA、蛋白表达显著升高,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:葱白提取物对脂肪变性肝细胞有明显的保护作用,其机制可能与PPAR-α、PGC-1基因表达上调有关。

抗肝细胞脂质堆积模型药物最佳筛选条件的研究

目的:利用小檗碱研究抗脂质堆积肝细胞模型药物的最佳实验条件.方法:将培养12h的HepG2细胞分为正常对照组(Con)、模型对照组(Model)和阳性对照药组(Ber).Con细胞仅用培养液培养,Model和Ber加入脂质堆积诱导液,后者再加不同浓度的小檗碱,分别观察不同的诱导时间对肝细胞脂质堆积的影响和对小檗碱治疗作用的影响.以油红0染色观察细胞内脂滴形成状况,并检测细胞内TG的含量.结果:1mM油酸钠、50nM胰岛素共同诱导48 h的实验条件可见肝细胞内有典型的脂滴形成,肝细胞内TG含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),终浓度10-5M小檗碱与模型对照组比较,能明显改善肝细胞脂质堆积,差异具有统计学意义((P<0.001)可为对照阳性药,此条件比较适合样品的筛选.结论:确定了该细胞模型用于药物筛选的最佳实验条件.

表达丙肝病毒核心蛋白基因的人肝细胞模型的建立

目的 构建表达丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCV C)基因的人肝细胞模型。方法 用聚合酶链反应 (PCR)方法从 pHCV MA质粒中钩出HCV C基因 ,酶切纯化后克隆于质粒 pTRE中 ,建立重组质粒 pTRE C。pTRE C经酶切、纯化后目的片段与质粒PcDNA3连接 ,通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒PcDNA3 tRe C ,由脂质体介导转染Chang liver人肝细胞 ,建立表达HCV C基因的人肝细胞模型 ,PCR方法鉴定Chang liver人肝细胞内HCV C基因 ,反转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测HCV C基因在Chang liver人肝细胞内的表达 ,抗生物素蛋白 生物素 过氧化物酶复合体法 (ABC法 )方法分析HCV核心蛋白在人肝细胞内的表达及定位。结果 构建了表达HCV C基因的重组真核表达载体 ,并在Chang liver人肝细胞中表达出HCV C蛋白。结论 成功地建立了表达HCV C基因的人肝细胞模型 ,该模型为进一步研究HCV C的生物学特性及HCV感染所致肝硬化、肝癌的致病机制提供基础材料。

高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型的建立及其在药物肝毒性评价中的应用

目的建立一种灵敏、快速的高细胞色素P450(CYPs)酶活性的大鼠原代肝细胞模型,用于评价经CYPs酶代谢后产生肝毒性的药物。方法分别采用苯巴比妥和β-萘黄酮两种CYPs酶广谱诱导剂构建大鼠原代肝细胞模型;应用"cocktail"探针底物法考察两种诱导剂对CYPs酶的影响;以基于CYPs酶代谢导致肝毒性的药物他克林(TAC)、双氯芬酸钠(DIC)和对乙酰氨基酚(PAR)为模型药物,评价所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型与普通大鼠原代肝细胞间灵敏性的差异;应用所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型评价维拉帕米(VER)的肝毒性。结果与普通大鼠原代肝细胞相比,3种模型药物在高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞中,在较低剂量时可使细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中活性氧(ROS)水平升高,线粒体膜电位(MMP)水平下降,或相同剂量下得到更严重的损伤结果,CYPs酶抑制剂1-aminobenzotriazole(ABT)和metyrapone(MET)能抑制这3种损伤的发生;100μmol/L维拉帕米在普通大鼠原代肝细胞中并未引起LDH、ROS和MMP的改变,但在高CYPs活性大鼠原代肝细胞模型中,会引起细胞损伤,ABT和MET能抑制这种损伤。结论经诱导建立的两种高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型能更灵敏的评价基于CYPs酶代谢致毒药物的肝毒性;两种诱导剂诱导得到的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型对经不同CYPs酶亚型代谢的药物评价结果有各自优势。应用高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型证实维拉帕米的致毒机制是经CYPs酶代谢产生肝毒性。

大鼠肝细胞分离及体外损伤模型建立

目的:分离大鼠肝细胞,建立体外大鼠肝细胞损伤模型。方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注分离大鼠肝细胞,培养液中加入不同浓度D-氨基半乳糖培养24 h,于培养1、3、6、12、24 h取上清测定ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸转移酶)、LDH(乳酸盐脱氢酶),同步测定肝细胞的细胞增殖活性(MTT)反应。结果:平均肝细胞产量(8.92±0.47)×108,Trypan blue拒染实验细胞活性率96.23%±2.41%,培养体系中加入D-氨基半乳糖后,部分肝细胞胞膜破损,随剂量增加及时间延长而逐渐加重;各剂量组随时间延长,培养上清液中生化指标水平逐渐升高,而MTT反应水平逐渐下降,以3 h与6 h变化最为明显;各时间点生化指标及MTT反应变化随剂量增加呈现相同趋势。结论:该方法可获得高产量高活性大鼠肝细胞;D-氨基半乳糖可成功诱导大鼠肝细胞体外损伤模型。

加味茵陈汤含药血清对体外大鼠肝细胞损伤模型的作用

目的建立肝细胞体外损伤模型,并观察加味茵陈汤含药血清对体外肝细胞损伤模型的作用。方法加味茵陈汤(茵陈、栀子、大黄、三七、丹参、赤芍、生地、丹皮、白芍、柴胡)用自动煎药包装机制成汤剂(2g生药／ml),利用改进的Seglen胶原酶(Ⅳ型)原位灌注分离大鼠肝细胞,培养液中加入不同浓度D-氨基半乳糖(D-GalN,0．2μg／ml、1μg／ml、5μg／ml、25μg／ml、125μg／ml)培养24 h,于培养1、3、6、12、24 h取上清测定ALT、AST、LDH,同步测定肝细胞的MTT反应以建立肝细胞体外损伤模型;以确定剂量中药加味茵陈汤(30 g／kg体质量,相当于60 kg体质量成人剂量10倍)灌胃给予大鼠制备中药药物血清,于肝细胞体外损伤模型加入含5％、10％、15％浓度中药血清培养24 h,以NS及正常大鼠血清做对照,于培养1、3、6、12、24

Fah^(-/-)Rag2^(-/-)IL2Rg^(-/-)小鼠肝脏原位异种重建模型的建立及其评价

目的:构建猪-小鼠肝细胞嵌合模型,探讨猪肝细胞在无T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)介导排斥条件下的移植及再生的相关条件,评估猪肝细胞在异种受体中的定居、增殖和功能因子分泌情况,为提高猪源化小鼠模型中猪肝细胞的重建效率提供依据。方法:采用脾脏内注射法将猪肝细胞移植至Fah^(-/-)Rag2^(-/-)IL2Rg^(-/-)(FRG)小鼠体内,构建移植模型。将16只FRG小鼠随机分为对照组、空白对照组、实验组和绿色荧光蛋白(GFP)基因实验组,每组4只。空白对照组小鼠停止给予2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,4-环己二酮(NTBC),监测体质量;对照组4只小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d;实验组小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d;GFP基因实验组小鼠注射携带GFP基因猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d。观察各组小鼠体质量、生存情况。检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,流式细胞术检测各组小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞表达情况,ELISA法检测各组小鼠血清中猪白蛋白表达水平,免疫组织化学法检测各组小鼠猪肝细胞再生效率。结果:与剪碎后再以胶原酶消化的方式比较,两步灌注法消化过程更温和、对细胞损伤更小,细胞活性可以达到92%。停止给予NTBC后,对照组小鼠体质量进行性降低,生命活力逐渐降低。连续停药第28天小鼠开始出现死亡现象。小鼠肝组织中出现肝细胞肿大、细胞浆疏松透亮和细胞核溶解等不可逆细胞损伤。空白对照组小鼠停药后血清中ALT水平逐渐升高。对照组停药小鼠重新给予NTBC后,体质量逐渐恢复至正常水平。流式细胞术,停止给予NTBC后,小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞完全缺失。免疫组织化学染色,实验组小鼠肝组织中未见深色Fah+阳性细胞,移植小鼠肝组织中可见深色Fah+阳性细胞,猪肝细胞再生效率为(11±4)%。GFP基因实验组小鼠可见同一视野经三色激光分别激发,猪肝细胞再生效率为(10±2)%。结论:成功构建了猪源化FRG小鼠肝脏嵌合模型,建立了长效稳定扩增猪肝细胞的小鼠模型。

三明治肝细胞培养模型及其在中药肝毒性评价中的应用

随着中药的广泛使用,安全性逐渐成为影响其临床应用的关键因素之一。肝脏作为机体主要的代谢场所,是药物毒性反应主要的靶器官之一,而使用高效、简便且可靠的体外模型对中药肝毒性进行评价和预警是当前毒理学研究的热点。三明治肝细胞培养模型能表达肝细胞血窦侧与胆管侧的转运体,形成功能性胆小管网络,并具有代谢能力,是研究药物肝胆转运和胆汁淤积的重要工具。对三明治肝细胞培养模型的特点、构建、影响因素及其在中药肝毒性评价中的应用进行综述,为中药肝毒性的评价方法研究提供参考。

肝再生增强因子调控线粒体功能稳态在棕榈酸诱导肝细胞脂毒性细胞模型中的作用

目的:研究肝细胞脂毒性细胞模型中线粒体内肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)与线粒体功能障碍之间的关系。方法:以无脂肪酸的10%牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)处理L-O2细胞为对照(BSA组),0.2 mmol/L棕榈酸(palmitic acid,PA)处理L-O2细胞为脂毒性细胞模型(PA组),并在构建ALR过表达(ALR-OE组)及对照(Vector组)细胞后,分别接受BSA和PA处理,CCK-8法检测细胞活力、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测脂毒性、JC-1染色分析线粒体膜电位、流式凋亡检测分析细胞凋亡,Western bolt检测ALR、Bax、Bcl-2、细胞色素C等蛋白表达水平。结果:与BSA组相比,PA组细胞内脂滴增多、细胞活力下降50%、LDH释放增加13倍,线粒体内ALR表达则明显降低。BSA处理下Vector组和ALR-OE组无明显差异,而PA刺激后ALR-OE组相较于Vector组,细胞活力增加约16%,LDH释放减少约40%,线粒体膜电位增加约18%,细胞色素C释放减少,细胞凋亡减少。结论:ALR参与肝细胞脂毒性的发生,靶向调控ALR可在一定程度上抑制脂毒性的发生。

原代肝细胞脂肪变性细胞模型的构建

目的为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病机制和防治研究提供可靠的原代肝细胞脂肪变性细胞模型。方法采用Seglen两步灌流法及其改良方法分离获取小鼠原代肝细胞,体外培养48 h后,给予不同浓度的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)混合物(油酸∶棕榈酸=2∶1)诱导24 h,采用油红O染色,观察肝细胞内脂滴沉积情况,全自动生化分析仪测定细胞内三酰甘油(TG)含量。结果与对照组相比,模型组肝细胞内出现红色脂滴沉积,且与加入的FFA混合物浓度呈剂量依赖性;模型组肝细胞内TG含量明显高于对照组(P<0.05),且随着加入的FFA浓度升高而增加,提示肝细胞内脂质沉积随着加入的FFA浓度升高而增加。结论成功构建了原代肝细胞脂肪变性细胞模型,为NAFLD的研究提供了可靠的细胞模型。

三维高通量肝细胞芯片模型的构建及其在中药肝毒性评价中的应用

本研究构建了一种高通量三维肝细胞模型,可模拟细胞在体内的三维生长空间,具有通量高、精密度好、成本低、操作简便的优势,可用于中药肝毒性的快速评价。首先,采用胶原水凝胶构建了三维高通量肝细胞芯片模型,以对乙酰氨基酚、昆明山海棠提取物和中药复方七厘散提取物为参照,对模型的精密度及与二维孔板模型的差异进行了考察,并对四个批次的昆明山海棠和复方七厘散提取物的肝毒性进行了评价,考察了方法的适用性。方法学考察结果显示,该模型的精密度和适用性良好,优于传统的二维孔板。接着,在三维肝细胞芯片模型上对不同样品给药3或7天的肝毒性进行了比较,发现中药成分的肝毒性随着给药时间的延长而增强。最后,对等生药量的单味中药昆明山海棠和复方中成药昆仙胶囊进行了肝毒性比较,发现中药配伍可以显著降低昆明山海棠的肝毒性。综上,本研究建立了一种高通量、稳定可靠的三维肝细胞芯片模型,可用于中药肝毒性的快速评价。

在“三明治”培养大鼠原代肝细胞中研究利福平及联用丹参酮ⅡA对普伐他汀经BSEP转运的影响

目的 以普伐他汀为BSEP底物,在“三明治”培养大鼠原代肝细胞模型上(sandwich-cultured rat hepatocytes, SCRH),研究利福平及联用丹参酮ⅡA对BSEP转运能力的影响。方法构建SCRH模型,利用MTT筛选给药剂量;建立普伐他汀的HPLC-MS/MS检测方法并进行方法学验证;考察利福平及联用丹参酮ⅡA对胆管内普伐他汀浓度的影响,并计算胆管外排指数(biliary excretion index, BEI)。结果成功构建了SCRH模型,并确定了利福平、丹参酮ⅡA、格列本脲及普伐他汀的合适给药剂量;建立了稳定可靠的普伐他汀HPLC-MS/MS检测方法;与空白组相比,利福平能够降低胆管内普伐他汀的浓度和普伐他汀的BEI,高浓度利福平的降低效果最明显( P <0.01);与利福平高浓度组相比,联用丹参酮ⅡA后,胆管中普伐他汀的浓度以及普伐他汀的BEI增大,高浓度丹参酮ⅡA的增加效果最明显( P <0.01)。结论在SCRH中,利福平能够抑制BSEP的转运能力,丹参酮ⅡA可以逆转利福平对BSEP转运能力的抑制作用。

体外肝细胞的制备及在药物开发中的应用

体外肝细胞模型(主要是原代肝细胞培养)作为一种强有力的体外研究体系被广泛应用于化学异物的肝毒性研究。由于肝细胞具有Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶和药物转运载体,肝细胞被应用于药代动力学领域的研究,如:动力学参数、清除率、种属间比较、酶抑制和诱导效应、药物转运载体、药物-药物相互作用等。体外肝细胞模型在毒理学领域也有广泛的应用,如:细胞毒性和基因毒性物质的筛选、化学保护剂的评价、特异性肝损伤及相关生化机制的测定等。到目前为止,体外肝细胞模型已在基础性研究和新药早期筛选中得到广泛应用。

槲皮素改善肝细胞脂质堆积作用的实验研究

目的探讨槲皮素(quercetin,Que)对肝细胞脂质堆积细胞模型的作用。方法将培养细胞分为空白对照组、模型组、阳性药小檗碱(10-5mol.L-1)、槲皮素高(10-4mol.L-1)、中(10-5mol.L-1)、低(10-6mol.L-1)组。正常对照组细胞仅用培养液培养;模型对照组在吸弃旧培养液后,换上脂质堆积诱导液诱导;阳性药及给药组分别换上脂质堆积诱导液,同时给予阳性药小檗碱(10-5mol.L-1)、槲皮素高(10-4mol.L-1)、中(10-5mol.L-1)、低(10-6mol.L-1)剂量;上述各组细胞继续培养48 h,进行油红染色,并在光镜下观察脂质堆积细胞病理变化;测定各组细胞吸光度的变化,计算抑制率。为了验证油红O实验的结果,同时测定了细胞内甘油三酯的水平。在诱导48 h后,收集细胞,裂解细胞,并测定细胞内的甘油三酯水平。结果模型对照组与空白对照组比较,其抑制率具有非常显著性差异(P<0.001),小檗碱及槲皮素高、中剂量与模型组比较具有非常显著性差异(P<0.001),槲皮素高、中剂量对脂质细胞的抑制率与阳性药相当,分别为60.7%、58.3%及55.2%,低剂量组与对照组比较不具有显著性差异(P>0.05)。经过诱导后,模型对照组细胞中的甘油三酯含量为正常对照组细胞的3倍。而在给予小檗碱和槲皮素处理后,可明显减少肝细胞中堆积的甘油三酯(P<0.05)。肝细胞中甘油三酯的变化与油红O染色实验的结果一致。结论槲皮素对非酒精性脂肪肝细胞模型具有降脂作用,并呈剂量依赖性。

药物代谢体外模型的研究进展

对药物代谢体外模型进行综述。介绍各模型的研究方法、特点和应用进展,为药物代谢的科学评价提供重要的参考。