人肝细胞生长因子(hdHGF)基因在毕赤酵母中的分泌表达

研究了hdHGF基因在毕赤酵母中的表达 .以人胎盘mRNA为模板 ,经逆转录、重叠PCR获得hdHGF全长和成熟基因片段 .将该基因片段克隆到pPIC9载体上 ,将重组表达质粒转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115,筛选mut+ 表型 ,经甲醇诱导可实现rhdHGF的分泌表达 .经摇瓶培养筛选出 4株表达水平较高的酵母工程菌株 ,SDS PAGE分析和Western印迹试验表明 ,产物分子量约为80kD ,5L发酵罐高密度培养已使生物量达 13 5g L(干重 ) ,发酵液上清总蛋白量为 8 0g L ,电泳结果表明rhdHGF表达水平为总蛋白的 12 3 % .

非小细胞肺癌患者肝细胞生长因子受体和表皮生长因子受体及间变性淋巴癌激酶基因异常与临床病理特征的关系

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者肝细胞生长因子受体(c-Met)、表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴癌激酶(ALK)基因异常与临床病理特征的关系。方法回顾性分析2021年1—12月新钢中心医院收治的152例NSCLC患者的临床资料,取患者组织标本,采用荧光原位杂交技术检测c-Met基因扩增情况,采用聚合酶链扩增反应及直接测序法检测EGFR基因突变情况,采用实时荧光定量PCR检测ALK基因重排情况。分析c-Met基因扩增、EGFR基因突变和ALK基因重排与患者临床病理特征的关系。结果152例NSCLC患者中,c-Met基因扩增7例,阳性率为4.61%;EGFR基因突变48例,突变率为31.58%;ALK基因重排8例,重排率为5.26%。c-Met基因扩增阳性与阴性患者、ALK基因重排与无重排患者性别、年龄、临床分期、吸烟史、肿瘤位置、病理类型比较差异无统计学意义。EGFR基因突变与无突变患者性别、年龄、病理类型比较差异有统计学意义(P<0.05),其中EGFR基因突变患者以女性、年龄<70岁、腺癌占比较高。结论c-Met基因扩增及ALK基因重排与患者临床病理特征无关,而EGFR基因突变与患者性别、年龄及病理类型密切相关。

肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化

目的应用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面转移相关的特征性糖谱。方法应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导建立肝癌上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)细胞模型。通过凝集素芯片比较诱导前后细胞膜的糖谱改变,采用凝集素印迹和荧光细胞凝集素免疫组化方法验证芯片结果。结果诱导后细胞对凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA的亲和作用减弱,而对凝集素AAL、ConA、DBA、GSLⅡ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTLⅡ和WFL的亲和作用增强。提示诱导后肝癌细胞表面出现了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α2,6唾液酸和末端α或β连接的N-乙酰半乳糖胺结构减少;而末端和核心岩藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺β1,6分支和复杂型寡糖分支结构增多。结论肝癌细胞发生EMT过程中细胞膜表面糖链结构改变,提示糖链结构与肝癌的转移密切相关,为有效控制肝癌转移、改善预后提供了新思路。

携带人肝细胞生长因子基因重组腺病毒的构建与制备

构建一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(AdHGF),并对其进行扩增、纯化与质量检测。首先构建携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒pXCJL1CMV/pAHGF,然后用LipofectAMIN介导该质粒和含有E1、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒GT4050共转染293细胞,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺病毒(AdHGF)。并以噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒,PCR法鉴定阳性重组腺病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,快速CPE分析、噬斑分析法测定病毒感染滴度(pfu/ml)。采用敏感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。结果成功构建了重组腺病毒AdHGF,制备的病毒纯度好、滴度高,其效价比小于1∶100,并且未检测到有复制能力的腺病毒存在。研究构建制备的重组腺病毒AdHGF具有潜在的实际应用价值。

银杏叶提取物对肝星状细胞增殖及转化生长因子和结缔组织生长因子基因表达的影响

目的:研究银杏叶提取物对肝星状细胞增殖及细胞因子TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表达的影响,以探讨银杏叶提取物抗肝纤维化的可能机制。方法:用不同浓度(0、1、10、100、500mg/L)的银杏叶提取物处理HSC-T6,用MTT及流式细胞仪检测其对肝星状细胞增殖及细胞周期的影响,用RT-PCR及Western blotting检测培养24h及48h后各组细胞中TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白的表达。结果:银杏叶提取物10、100、500mg/L可抑制肝星状细胞的增殖,与空白对照组相比,G0/G1期DNA含量逐渐增加(P<0.05或P<0.01),S期DNA含量则逐渐降低(P<0.01),增殖指数(PI)逐渐降低(P<0.05或P<0.01);24h各组TGF-β1mRNA及蛋白表达较对照组分别低(28±4)%、(39±4)%、(45±3)%(P<0.01);(27±4)%、(37±4)%、(41±3)%(P<0.01);48h组各组TGF-β1mRNA及蛋白表达较对照组分别低(35±4)%、(49±3)%、(54±3)%(P<0.01);(33±4)%、(48±3)%、(52±3)%(P<0.01);4h各组CTGF mRNA及蛋白表达较对照组分别低(29±6)%、(45±4)%、(56±3)%(P<0.01);(36±4)%、(48±4)%、(49±3)%(P<0.01);48h组各组CTGF mRNA及蛋白表达较对照组分别低(48±6)%、(57±4)%、(69±3)%(P<0.01);(44±6)%、(58±4)%、(62±3)%(P<0.01)。结论:银杏叶提取物可能通过抑制肝星状细胞的增殖,抑制细胞因子TGF-β1、CTGF基因的表达发挥其抗肝纤维化的作用。

肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞异体移植修复烧伤创面

背景:经携带人肝细胞生长因子的重组腺病毒(adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor,Ad-HGF)修饰的骨髓间充质干细胞创面移植后,可分化为"修复细胞",并能够在创面持续释放肝细胞生长因子。目的:观察Ad-HGF基因转染的骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠烧伤创面愈合的影响。设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2006-02/2007-03在解放军兰州军区兰州总医院临床实验科和烧伤整形科实验室完成。材料:Wistar大鼠40只,由解放军兰州军区兰州总医院动物实验科提供。Ad-HGF与携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒(adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor,Ad-GFP)颗粒均由哈小琴博士惠赠。方法:取雄鼠10只,Percoll密度梯度离心法体外分离培养骨髓间充质干细胞,并行Ad-HGF转染。取雌鼠30只,随机分为未转染细胞组、Ad-HGF转染细胞组、Ad-GFP转染细胞组、Ad-HGF对照组、假伤组,6只/组。前4组大鼠复制背部深Ⅱ度烧伤模型,并分别于创面真皮层下方多点注射对应的细胞悬液或病毒悬液1mL;假伤组大鼠背部剃毛后浸入37℃温水12s模拟烧伤,同法注射等量生理盐水。主要观察指标:对采集的创面标本行组织学观察和羟脯氨酸含量测定,采用免疫组化分析创面肝细胞生长因子的表达。结果:苏木精-伊红染色结果显示,Ad-HGF转染细胞组移植后7d创面表皮化优于其他组,至21d再生表皮明显厚于其他组,并可见真皮钉脚下伸。胶原特殊染色结果显示,Ad-HGF转染细胞组移植后7,21d创面中的胶原排列较其他组整齐。移植后7d,Ad-HGF转染细胞组羟脯氨酸含量显著低于其他组(F=3.216,P<0.01)。移植后21d,Ad-HGF转染细胞组愈合创面中肝细胞生长因子的阳性表达位于真皮层,表达强度明显强于其他组。结论:Ad-HGF基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞异体移植后,对烧伤创面愈合存在一定的促进作用。

人肝细胞生长因子基因表达质粒的构建及其活性研究

目的 :构建一种携带人肝细胞生长因子 (HGF)基因的表达质粒 (pUDKH) ,并对其体外活性进行研究 ,为其体内应用提供依据。方法 :从人胎盘cDNA文库用PCR方法克隆人HGF基因 ,并将其克隆至自行构建的真核表达载体 pUDK上 ,获得表达质粒 pUDKH。将pUDKH体外转染原代培养的骨骼肌细胞 ,分析其转染效率及表达上清中HGF、血管内皮生长因子 (VEGF)的表达水平 ,并采用MTT法分析不同剂量HGF表达产物对人脐静脉内皮细胞的作用。结果 :所克隆构建的携带人HGF基因的质粒 pUDKH可有效转染原代培养的骨骼肌细胞 (0 .0 5 7% ) ,并表达HGF(16～ 18ng/ 4× 10 5cells)和VEGF ,其表达产物对人脐静脉内皮细胞具有明显的增殖刺激活性 (P <0 .0 5 ) ,而且有剂量效应关系。结论 :初步证实本研究构建的质粒

人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子基因修饰后的促进鸡胚血管新生

本研究目的是评价人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMMSC)经肝细胞生长因子基因(hepatocyte growth factor,HGF)修饰后的促血管新生效应,并初步分析其机理。利用重组腺病毒HGF转染hBMMSC,将细胞接种于鸡胚绒毛膜尿囊膜,与α-MEM、同代hBMMSC及bFGF比较,3天后计算其血管数量。用RT-PCR检测hBMMSC表达bFGF、VEGF、血管生成素-1和血管生成素-2的水平。结果表明:4个组中hBMMSC/HGF促血管生成能力最强,hBMMSC和bFGF组相近,α-MEM组最低。RT-PCR检测显示,hBMMSC和hBMMSC/HGF均表达多种促血管生成相关细胞因子,而HGF转染后表达水平升高。结论:经HGF基因修饰的hBMMSC具有较强的促血管新生的功能,本研究为缺血性疾病的治疗提供了有益的信息。

肝细胞生长因子及其受体基因在人肝癌和癌旁肝组织中的表达

目的：了解肝细胞生长因子（ＨＧＦ）及其受体基因在人肝癌和癌旁肝组织中表达的变化规律，以及这种变化与肿瘤生物学行为的关系。方法：采用地高辛标记的ＨＧＦ及其受体ＤＮＡ探针，检测２６例人原发性肝癌及其癌旁肝组织中ＨＧＦ及其受体基因的表达。结果：ＨＧＦ在人肝癌和癌旁肝组织中虽都有表达，但阳性率不及其受体基因表达，ＨＧＦ受体在肝癌和癌旁肝组织中均呈过度表达，且肝癌组织中杂交信号明显高于癌旁肝组织，有肝内外转移者其表达更高。结论：ＨＧＦ受体基因过度表达与肝癌的转移密切相关，ＨＧＦ及其受体系统对调节肿瘤生长。

重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因治疗大鼠肝纤维化的实验研究

目的:评价携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的重组腺病毒对大鼠肝纤维化模型的治疗作用。方法:DMN法建立W istar大鼠肝纤维化模型后,将8.6×109pfu的Ad-HGF经尾静脉注射入大鼠体内,对照组注射同剂量的Ad-GFP。第40天心脏采血,检测血清GPT、GOT、TP和TB il,并取肝组织做HE染色,观察两组大鼠肝脏的病理形态。结果:治疗组部分动物肝功能有所改善,对照组不明显。与对照组相比,治疗组大鼠的肝组织损伤程度较轻,汇管区看不到明显的纤维增生,并可见双核肝细胞和分裂相细胞。结论:腺病毒介导的HGF基因可能有部分治疗大鼠肝纤维化的作用。

动物肝细胞生长因子(HGF)基因生物信息学分析

肝细胞生长因子（HGF）是一种多功能细胞因子。最初发现HGF具有调节肝脏生长的重要功能，随着研究的不断深入，其生物学功能也逐渐被揭示。

肝细胞生长因子基因治疗周围动脉闭塞症研究进展

目的综述利用肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)基因治疗周围动脉闭塞症(peripheralarterialdisease,PAD)的实验研究和临床试验。方法查阅近年来对大鼠、家兔、犬及糖尿病大鼠缺血肢体模型或临床患者缺血部位转染HGF质粒DNA后,评价缺血肢体血流量、血管密度、血压及缺血性溃疡等相关文献。结果缺血肢体模型转染HGF质粒DNA后,缺血肢体血流量、血管密度及血压均有显著增加。肌肉注射携带HGF质粒DNA对荷瘤小鼠的肿瘤生长和转移无促进作用。/a期临床试验表明,6例患者均未观察到与基因治疗相关的不良反应,踝部绝对血压、血压指数增高,可视模拟疼痛尺度减低,缺血性溃疡长径减小、愈合或明显改善。结论携带HGF质粒DNA可能成为治疗PAD的一种新手段。

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景:骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的:验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法:腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射:①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子+肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论:除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善(P<0.05),其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子+肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生(P<0.05),而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子+肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。

肝细胞生长因子基因重组腺病毒修饰间充质干细胞修复急性放射性损伤大鼠的创面

背景:基因药物与干细胞联合应用促进难治性大面积创面修复。目的:观察携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(adenovirus hepatocyte growth factor,Ad-HGF)修饰的间充质干细胞对大鼠皮肤放射性损伤创面促愈合的作用。方法:体外分离、培养雄性Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,转染Ad-HGF后备用。40只雌性Wistar大鼠用X射线局部照射制备急性放射性皮肤损伤模型。并将模型大鼠随机分为单纯间充质干细胞治疗组、单纯Ad-HGF治疗组、Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组、溶剂对照组4组,制备模型即刻各组将相应细胞悬液、病毒悬液及溶剂行创面边缘多点注射。结果与结论:苏木精-伊红染色结果显示,伤后21d Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组再生表皮明显薄于溶剂对照组,并可见丰富的新生小血管,且表皮较单纯间充质干细胞治疗组和单纯Ad-HGF治疗组更平整,新生小血管更丰富;免疫组织化学结果表明,Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组创面中肝细胞生长因子表达均强于其他组;羟脯氨酸含量Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组在7d后显著低于其他组(P<0.05);原位杂交结果显示,Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组修复的皮肤组织中性别决定基因sry表达强于单纯间充质干细胞治疗组。结果提示,Ad-HGF修饰的间充质干细胞对皮肤放射性损伤创面有显著的促愈合修复作用,且优于二者单独应用。

肝细胞生长因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞促进大鼠肢体血管新生

目的评价肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)修饰的人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)体内促血管新生效应,探讨其作用机制。方法结扎Wistar大鼠右侧股动脉,建立局部肢体缺血模型。将hMSC、hMSC/Ad-HGF或PBS,通过肌肉注射接种于缺血区,21d后以对侧肢体为正常对照,进行激光多普勒灌注成像测定、HE染色和免疫组化检查,评价骨骼肌微血管密度。以MTT、Transwell及内皮细胞体外管状结构形成实验,评价hMSC/Ad-HGF对血管内皮细胞的体外增殖、迁移及成管状能力的影响。结果 21d后,hMSC/Ad-HGF和hMSC组血流灌注水平明显高于对照组(P<0.01),前者接近PBS组,显著高于hMSC组(P<0.05)。组织学分析表明,每高倍视野肌肉组织中,hMSC/Ad-HGF组微血管数量最高,PBS组和hMSC组次之,对照组最低(P<0.01)。hMSC/Ad-HGF培养上清可明显促进ECV304细胞的增殖,刺激作用高于表皮生长因子(20ng/mL,P<0.001);促进细胞跨膜迁移和管状样结构形成,强于表皮生长因子。结论 hMSC/Ad-HGF可促进血管内皮细胞的增殖、迁移及血管结构重建,从而引发血管新生效应。

肝细胞生长因子对肺癌细胞运动和侵袭的影响及原癌基因C-met的表达

肝细胞生长因子（ＨＧＦ）可调节许多细胞的运动和生长，检测了ＨＧＦ对５种人类非小细胞肺癌细胞运动和侵袭的作用，有３种细胞的运动和侵袭力在ＨＧＦ刺激后增加。用ＲＮＡ印迹检测ＨＧＦ受体——原癌基因Ｃ－ｍｅｔ产物，可证实这几种细胞均有Ｃ－ｍｅｔｍＲＮＡ存在。细胞蛋白印迹检测进一步证实了ＨＧＦ受体的存在。这些结果表明ＨＧＦ可能在人类非小细胞肺癌的侵袭和转移方面扮演重要角色。

肝细胞生长因子基因转染脂肪细胞对移植组织工程脂肪存活的影响

背景:在脂肪组织工程的研究中,若将种子细胞与支架材料复合后移植,则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪。肝细胞生长因子可以促进血管生成、减少纤维组织增生。目的:观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织工程脂肪移植存活的影响。设计、时间及地点:随机区组设计的动物实验,于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院医学科学实验中心完成。材料:纳入Wistar大鼠用于分离、培养骨髓间充质干细胞及植入细胞-支架复合物。方法:①分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞,诱导成脂,携带绿色荧光蛋白基因及肝细胞生长因子基因的重组腺病毒毒株分别转染脂肪细胞,流式细胞仪测定转染效率,应用酶联免疫吸附试验法测定培养上清中肝细胞生长因子的表达,将脂肪细胞接种于聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架。②将75只Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为3组:脂肪细胞组、Ad-肝细胞生长因子转染组及Ad-绿色荧光蛋白转染组分别将脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染肝细胞生长因子基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染绿色荧光蛋白基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物移植于大鼠腿部肌肉之间。主要观察指标:移植后3,7,14,28,60d,每组各取5只大鼠麻醉后处死,取出移植物。电镜观察;并行苏木精-伊红、油红O、Masson’s染色,观察病理改变;同时用免疫组织化学法检测组织中肝细胞生长因子表达,观察并计数血管生成。结果:①骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞胞浆内富含丰富的脂滴,重组腺病毒感染复数=100时,携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒株转染脂肪细胞效率可达64.39%。②移植3,7,14d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中肝细胞生长因子的表达高于其他组(P<0.05),且3d达到高峰。③移植3,7,14,28,60d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中血管生成高于其他组(P<0.05),且7d时血管增加的幅度最大。④移植28,60d时,Ad-肝细胞生长因子转染组坏死程度均小于其他组,电镜下脂肪细胞也多于其他组。结论:携带肝细胞生长因子基因的脂肪细胞在移植物中能够表达肝细胞生长因子,促进移植组织工程脂肪血管生成,进而促进移植组织的成活。

RhoC基因对肝癌细胞促血管生长因子表达的影响

目的观察RhoC基因对肝癌HepG2细胞表达促血管生长因子(VEGF,bFGF)的影响。方法将pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1转染HepG2细胞,用RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞的RhoCmRNA及RhoC蛋白表达情况;RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞VEGF和bFG-FmRNA及蛋白的表达。将转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1的HepG2细胞接种裸鼠,观察肿瘤的成瘤率。结果与转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞相比,转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒的细胞表达RhoCmRNA及RhoC蛋白增强,其表达VEGF和bFGFmRNA及蛋白明显增强(P<0.01);重组质粒转染组成瘤率高于空载体组。结论RhoC表达可促进HepG2细胞表达血管内皮生成因子。RhoC可促进肝癌细胞分泌促血管生长因子,可能是促进肝癌侵袭、转移的机制之一。

肝细胞生长因子(HGF)对脂肪移植存活的影响

目的探讨解决脂肪移植存活率低的有效途径。方法选用Wistar大鼠18只,随机分为3组,每组6只,分别用10 ng/ml HGF、1 ng/ml HGF、生理盐水处理三组,移植1个月后分别采集移植的脂肪组织,测量纯移植体的体积,对不同实验组和对照组大鼠行HE染色观察移植组织病理学变化。结果10 ng/ml和1 ng/ml HGF处理组的移植体的存活量高于盐水处理组的存活量P<0.05),10 ng/ml和1 ng/ml HGF处理组间的存活量差异无显著意义(P>0.05)。结论一定浓度的HGF对移植鼠颗粒脂肪组织有促进其血管增生的作用,可以提高移植后脂肪组织存活量。