肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物过表达促进心肌细胞自噬

目的:构建和包装携带肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs)全长基因的重组腺病毒,并研究Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。方法:PCR扩增Hgs全长cDNA,将其连接到pMD18-T载体上,测序确认正确后将其克隆到腺病毒穿梭载体pAd Track-CMV,该载体线性化后转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞,与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-Hgs;将pAd-Hgs线性化后经脂质体转染293A细胞进行Ad-Hgs病毒的包装与扩增;用得到的Ad-Hgs腺病毒感染心肌细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western印迹、real-time PCR确认病毒感染的有效性以及Hgs过表达情况;通过Western印迹检测自噬标志物LC3的转换(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ),以分析Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。结果:包装了携带Hgs基因的重组腺病毒Ad-Hgs;Ad-Hgs重组腺病毒感染心肌细胞后,荧光显微镜观察到明显的GFP表达;real-time PCR、Western印迹结果显示Hgs在心肌细胞中得到过表达;Western印迹结果证明,Hgs过表达导致心肌细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显升高。结论:通过包装携带Hgs cDNA的重组腺病毒,发现Hgs过表达促进心肌细胞自噬。

肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物对胰岛素表达和分泌的影响

目的探讨肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(HGS)对胰岛素表达和分泌的影响。方法检测HGS,胰岛素和胰升血糖素在小鼠胰岛中的分布。检测不同浓度葡萄糖(5.5、11.1及16.7mmol/L)培养24h后NIT-1细胞HGS表达水平和胰岛素的分泌。观察siRNA沉默HGS表达后48h NIT-1细胞胰岛素的表达和分泌的变化。结果 HGS免疫阳性细胞特异性分布于小鼠胰腺的胰岛,并与胰岛素共定位于胰岛β细胞中,未见HGS和胰高血糖素阳性荧光双标细胞。不同浓度葡萄糖培养NIT-1细胞24h,5.5mmol/L组为(25.07±0.93)μIU/mg,11.1mmol/L组为(32.28±0.93)μIU/mg,16.7mmol/L组为(41.77±1.39)μIU/mg,NIT-1细胞分泌胰岛素水平逐渐增加(P<0.01)。各组HGS蛋白水平也随葡萄糖浓度增加而逐渐增加(P<0.05)。siRNA沉默HGS表达后NIT-1细胞内胰岛素的表达水平无明显变化,但胰岛素分泌水平减少(P<0.05)。结论 HGS选择性表达于胰岛β细胞中,并调节胰岛素的分泌。

肝细胞生长因子在肿瘤疾病中的作用研究进展

肿瘤是全球范围内的主要死亡原因。受体酪氨酸激酶(c-MET)及其配体肝细胞生长因子(HGF)是肿瘤相关信号传导网络中一对重要的受体-配体,此信号轴(HGF/cMET)参与并介导了肿瘤发生发展进程,HGF/c-MET途径已成为许多实体瘤中重要的可操作靶标。因此,为了指导临床干预和患者分层,朝着个性化医学发展的目的,生物标志物的发现变得至关重要。

c-Met激酶抑制剂LY28对PC-3、NCI-H441、MDA-MB-231细胞和PC-3移植瘤的抑制作用

目的观察肝细胞生长因子受体(c-Met)酪氨酸激酶抑制剂LY28的抗肿瘤作用,并探讨其机制。方法1取对数生长期人前列腺癌PC-3细胞、人肺癌NCI-H441细胞及人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于96孔板,培养24 h后分为1个对照组和14个实验组。对照组用0.04%DMSO的培养基培养,实验组分别用0.1、1、10、20、40、80、100μmol/L的LY28、克唑替尼培养,每组3个复孔。各组细胞置于培养箱中孵育72 h后弃培养基,每孔加入0.5 mg/m L的MTT溶液100μL。培养箱中孵育4 h,在酶标仪570 nm波长处检测各孔光密度(OD)值。计算细胞增殖抑制率,采用Graphpad Prism5软件计算LY28、克唑替尼抑制肿瘤细胞增殖的IC50值。2制作PC-3细胞移植瘤裸鼠模型。挑选模型裸鼠40只,随机分为模型组和给药组(包括LY28 10 mg/kg组、LY28 20 mg/kg组、LY28 40mg/kg组及克唑替尼组),每组8只。给药组分组当天即开始每天单次灌胃给予10 mg/kg的LY28、20 mg/kg的LY28、40 mg/kg的LY28、40 mg/kg的克唑替尼,周期21 d。模型组给予等量生理盐水。末次给药结束后处死裸鼠,剥离肿瘤组织。称瘤重并计算抑瘤率。采用Western blotting法检测肿瘤组织中的Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2。结果 LY28对PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441细胞的IC50分别为(10.154±1.209)、(18.946±2.457)、(29.868±3.493)μmol/L,克唑替尼对PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441细胞的IC50分别为(19.105±2.970)、(39.818±5.694)、(34.982±4.977)μmol/L。LY28对PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441细胞的IC50均低于克唑替尼(P均<0.05)。LY28 10 mg/kg组、LY28 20 mg/kg组、LY28 40 mg/kg组、克唑替尼组抑瘤率分别为38.38%、67.17%、80.30%、77.27%。与模型组比较,LY28 10 mg/kg组、LY28 20 mg/kg组、LY28 40 mg/kg组及克唑替尼组p-MET及其下游信号p-Akt、p-ERK1/2水平降低(P均<0.05),且LY28 40 mg/kg组<LY28 20 mg/kg组<LY28 10mg/kg组(P均<0.05)。结论 LY28有较好的抗肿瘤活性,可能是通过抑制c-Met信号通路磷酸化发挥抗肿瘤作用。