人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的O-糖链的比较分析

以培养的原发性肝细胞癌Hep G2细胞和正常肝细胞L02为研究对象,用细胞裂解液提取总蛋白,然后采用Carlson还原性β-消除法释放O-糖链,以阳离子交换柱结合C18柱纯化分离O-糖链,用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对O-糖链进行序列鉴定,以β-环糊精为内标对2种细胞系的O-糖链进行定量比较分析.结果表明,在肝癌细胞系Hep G2中检测到10种O-糖链,正常细胞系L02中检测到9种O-糖链,其中9种O-糖链是2种细胞系中共有的,但Hep G2中存在癌细胞中特有的缩短的O-糖链N1A1(Neu Ac-Gal NAc,sialyl Tn抗原).t检验结果表明,Hep G2与L02相比,在检测到的10种O-糖链中有5种的含量具有极显著性差异(P<0.01),2种的含量具有显著性差异(P<0.05).

α-苦瓜素经LRP1受体介导的JNK信号通路诱导肝细胞L02早期凋亡的机制研究

目的:探讨α-苦瓜素诱导肝细胞L02(简称"L02细胞")早期凋亡的信号通路。方法:制备并纯化α-苦瓜素。采用流式细胞术检测0(阴性对照)、160、80μg/mLα-苦瓜素作用L02细胞2～8 h后的细胞凋亡率。小干扰RNA(siRNA)沉默低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)得到LRP1-siRNA细胞,然后采用液相芯片分析术检测α-苦瓜素(160μg/mL)分别作用L02细胞(正常组)和LRP1-siRNA细胞(沉默组)0、0.25、0.5、1、2 h后c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路中促调蛋白磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化凋亡前体蛋白(p-Bad)、胱天蛋白酶9(Caspase-9)及抑调蛋白磷酸化蛋白53(p-p53)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化B淋巴细胞瘤2(p-Bcl-2)、Caspase-8的表达情况,分析α-苦瓜素对L02细胞JNK信号通路的作用。结果:制备并纯化得到α-苦瓜素(纯度>97%);与阴性对照组比较,160μg/mLα-苦瓜素作用8 h时,可显著诱导细胞早期凋亡(P<0.05),80μg/mLα-苦瓜素诱导的早期凋亡不明显(P>0.05);与0 h比较,作用后0.25 h促调蛋白p-JNK、p-Bad和Caspase-9表达量显著增加(P<0.05),而抑调蛋白pp53、p-Akt、p-Bcl-2和Caspase-8表达量无变化;与正常组相比,沉默组各时间点的p-JNK、p-Bad和Caspase-9的表达均显著减少(P<0.05)。结论:α-苦瓜素可能通过LRP1受体介导JNK信号通路诱导肝细胞凋亡,为揭示其肝毒性提供了参考。

基于电喷雾电离质谱的人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的N-糖链的定性定量比较

以培养的原发性肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02为研究对象,采用细胞裂解液提取总蛋白,用PNGase F酶解释放N-糖链,以微晶纤维素柱结合石墨碳柱纯化分离N-糖链,通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对N-糖链进行序列鉴定,以β-环糊精为内标对2种细胞系的N-糖链进行了定量比较分析.结果表明,在肝癌细胞系HepG2和正常细胞系L02中共检测到26种N-糖链,与L02相比,HepG2的大多数高甘露糖型糖链、唾液酸化糖链和岩藻糖基化糖链的数量都明显升高,其中有15种糖链在数量上具有极显著性差异(p<0.01),1种糖链具有显著性差异(p<0.05).本研究为进一步探索肝癌中各类N-糖链的表达特点及发现早期肝癌糖链标志物提供了参考.

补骨脂及其主要成分对人正常肝细胞L02的损伤作用研究

目的:对比研究补骨脂及其主要成分(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚、补骨脂定)对人正常肝细胞L02的损伤作用差异。方法:以L02肝细胞系作为评价模型,采用MTT方法检测不同时间点(24,48,72 h)补骨脂及其主要成分对L02细胞增殖的影响;根据试剂盒说明书,采用生化法检测其对丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性及乳酸脱氢酶(LDH)释放率的影响。结果:500 mg生药量/L补骨脂950 mL/L乙醇提取物作用L02细胞24 h的抑制率为52.71%。相同时间点、相同质量分数下,补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂定和补骨脂酚对L02细胞的抑制率较高,而补骨脂素和异补骨脂素对L02细胞的抑制率相对较低;且补骨脂乙素、补骨脂酚对L02细胞的抑制率较补骨脂甲素和补骨脂定低。生化检测结果显示,补骨脂甲素和补骨脂定对LDH释放率的影响均大于补骨脂乙素、补骨脂酚、补骨脂素和异补骨脂素,但对ALT和AST活性无明显影响。结论:在一定质量分数范围内,补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚及补骨脂定对L02细胞均具有一定的细胞毒性,可能与补骨脂的肝损伤毒性有关;相同时间点、相同质量分数下,补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂定和补骨脂酚的毒性大于补骨脂素及异补骨脂素。

体外不同条件诱导L02肝细胞损伤模型的构建

目的探讨不同条件下诱导L02肝细胞损伤的最佳条件,建立稳定可靠的体外肝细胞损伤模型。方法将常规培养的L02细胞分别设置为正常对照组、过氧化氢(H_(2)O_(2))组、对乙酰氨基酚(APAP)组和乙醇组;H_(2)O_(2)组用不同浓度梯度(300、400、500和600 mol/L)的H_(2)O_(2)分别诱导6、12和16 h;APAP组以不同浓度梯度(1、10、20和40 mmol/L)分别诱导3和6 h;乙醇组加入不同浓度梯度(0.5%、1%、1.5%和2%)的乙醇分别孵育6和24 h;在上述损伤条件下用细胞计数试剂盒(CCK)-8检测各组L02细胞的存活率。在确定的最佳损伤条件下,建立不同肝损伤模型,检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)等损伤指标。结果除300 mol/L H_(2)O_(2)诱导12 h以外,其余不同浓度H_(2)O_(2)组的细胞存活率均低于正常对照组(均<0.05)。不同浓度APAP组的细胞存活率均低于正常对照组(均<0.05),尤其是40 mmol/L的APAP更为明显。乙醇诱导6 h后,不同浓度乙醇组的细胞存活率均明显下降,1.5%和2%乙醇的细胞存活率均低于正常对照组(均<0.05);此外,不同浓度的乙醇诱导24 h可以引起L02细胞大量坏死。H_(2)O_(2)模型组、APAP模型组和乙醇模型组的细胞存活率、SOD活性均低于正常对照组(均<0.05),而ALT、AST、MDA含量均高于正常对照组(均<0.05)。结论分别用300mol/L H_(2)O_(2)诱导6 h、40 mmol/L APAP作用3 h和1.5%的乙醇作用6 h的L02肝细胞所形成的肝损伤模型比较稳定,是体外模拟氧化性、药物性和酒精性肝损伤模型的最佳诱导条件。

UPLC-QTOF/MS分析芫花诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础

目的:研究芫花提取物诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础。方法:选取人肝细胞L02作为体外实验模型,运用MTT法测定芫花提取物对细胞增殖的影响,并且采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)对芫花提取物及与L02细胞亲和后胞内化学成分进行定性分析。结果:芫花提取物对L02细胞的生长抑制呈明显的剂量依赖关系,48 h的IC50为(48.34±4.66)mg.L-1。通过UPLC-QTOF/MS鉴定的黄酮类成分主要有:芹菜素、3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮;二萜原酸酯类成分主要有:芫花酯戊、genkwanine L、芫花酯丙、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯庚、芫花酯乙、芫花酯己、芫花酯甲。在芫花提取物亲和的L02细胞中鉴定出3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮、芫花酯戊、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯乙、芫花酯甲。其中二萜原酸酯类成分芫花酯甲作用L02细胞48 h的IC50为(29.57±2.01)mg.L-1,黄酮类成分芫花素(0.1～100 mg.L-1)未发现对L02有显著的细胞毒作用。结论:芫花提取物对人肝细胞L02具有细胞毒作用,其中二萜原酸酯类成分与细胞有明显的亲和作用,并具显著的细胞毒作用,是芫花提取物中主要的活性物质。

雷公藤甲素诱导正常人肝细胞L02的毒性及甘草酸二铵的保护作用

目的:研究雷公藤甲素(triptolide,TP)诱导的正常人肝细胞L02的毒性及甘草酸二铵(diammonium glycyrrhizinate,DG)保护作用。方法:首先利用CCK-8法测定不同浓度TP对L02的毒性,然后研究DG预处理48 h后对TP诱导L02毒性的影响。利用活性氧(ROS)探针结合高内涵,研究不同浓度DG预处理对TP诱导L02 ROS的影响。进一步利用CYP3A4苯妥因诱导剂和酮康唑抑制剂阐明肝药酶在DG解毒中的作用。结果:经细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK-8)法测定,L02经TP孵育1、2和4 h时,IC50分别为26、14和8μmol·L-1。当正常人肝细胞经DG(10、100和1 000μmol·L-1)预处理48 h后,再与TP共同孵育1 h,DG 10和100μmol·L-1组的IC50分别升高至58、79μmol·L-1,而DG 1 000μmol·L-1组的IC50则降低至18μmol·L-1。TP诱导L02产生ROS呈现明显的剂量相关性。DG(10和100μmol·L-1)预处理48 h后可明显降低TP诱导ROS的能力。CYP3A4的诱导剂与DG共同预处理后,可显著性降低TP诱导ROS的能力。CYP3A4的抑制剂和DG共同预处理,反证诱导CYP3A4可能是DG保护作用的机制之一。结论:本研究提示TP诱导L02的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加,产生毒性作用;低浓度和中浓度DG可以显著性降低TP对L02的毒性,而高浓度DG反而增强TP对L02的毒性。DG诱导CYP3A4上调和降低ROS水平对减轻TP诱导的正常肝细胞毒性起到重要作用。

大黄素对人胚胎肝细胞L02细胞株法尼醇X受体的调节作用

目的研究大黄素对人胚胎肝细胞L02细胞株法尼醇X受体（FXR）通路的调节作用。方法模型组采用孕二烯二酮（Guggulsterones）对L02细胞株的FXR基因干预，根据大黄素剂量分为高剂量、中剂量、低剂量组（50.0 μmol/L、25.0 μmol/L、12.5 μmol/L），另设对照组。采用实时荧光定量PCR与Western blot检测FXR及下游小异源二聚体伴侣受体（SHP）、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸转移酶2B4（UGT2B4）、胆盐输出泵（BSEP） mRNA及蛋白表达。结果1．模型组FXR mRNA及蛋白相对表达量（0.240±0.021、0.385±0.119）较对照组（1.000±0.088、1.000±0.223）显著降低，差异均有统计学意义（t＝14.62、4.21，均P〈0.01）；与模型组比较，大黄素高、中、低剂量组FXR mRNA相对表达量（0.755±0.083、0.817±0.097、0.547±0.080）显著升高，差异均有统计学意义（t＝10.42、10.03、6.39，均P〈0.01）；中剂量组FXR蛋白相对表达量（0.865±0.203）显著升高，差异有统计学意义（t＝3.53，P〈0.01）；高、中剂量组FXR mRNA相对表达量（0.755±0.083、0.817±0.097）均高于低剂量组（0.547±0.080），差异均有统计学意义（t＝3.11、3.70，均P〈0.01）。2.模型组SHP、UGT2B4、BSEP mRNA及蛋白相对表达量（0.148±0.025、0.205±0.039、0.184±0.020，0.458±0.130、0.255±0.170、0.303±0.100）较对照组（1.000±0.099、1.000±0.104、1.000±0.125，1.000±0.129、1.000±0.157、1.000±0.162）显著降低，差异均有统计学意义（t＝14.50、12.44、11.19、5.13、5.57、6.33，均P〈0.01）。高、中、低剂量组SHP、UGT2B4、BSEP mRNA相对表达量（0.610±0.058、0.514±0.041、0.707±0.062，0.755±0.108、0.800±0.086、0.727±0.076，0.470±0.070、0.582±0.050、0.500±0.108）较模型组（0.148±0.025、0.205±0.039、0.184±0.020）显著升高，差异均有统计学意义（t＝12.75、9.38、13.94、9.46、10.90、11.96、7.53、10.31、5.00，均P〈0.01）；高、中剂量组SHP、UGT2B4、BSEP蛋白相对表达量（0.658±0.091、0.624±0.113、0.607±0.097，0.868±0.194、0.883±0.099、0.913±0.131）较模型组（0.458±0.130、0.255±0.170、0.303±0.100）显著升高，差异均有统计学意义（t＝2.18、3.13、3.78、3.05、5.53、6.41，均P〈0.01），低剂量组SHP、BSEP蛋白相对表达量（0.645±0.135、0.572±0.076）不同程度升高，差异均有统计学意义（t＝1.73，P〈0.05，t＝3.72，P〈0.01）。大黄素高、中剂量组BSEP蛋白相对表达量（0.607±0.097、0.913±0.131）均高于低剂量组（0.572±0.076），差异均有统计学意义（t＝1.99、3.90，均P〈0.01）；高、低剂量组SHP、UGT2B4 mRNA相对表达量（0.610±0.058、0.470±0.070，0.514±0.041、0.582±0.050）均低于中剂量组（0.800±0.086），差异均有统计学意义（t＝3.75、6.47、3.83、3.42，均P〈0.01）；高、低剂量组UGT2B4、BSEP蛋白表达量（0.624±0.113、0.644±0.097，0.607±0.097、0.572±0.076）均低于中剂量组（0.883±0.099、0.913±0.131），差异均有统计学意义（t＝4.27、2.98、6.30、3.90，均P〈0.01）。结论Guggulsterones能抑制L02细胞株FXR及下游SHP、UGT2B4、BSEP基因表达，大黄素可通过对FXR基因表达上调，促进SHP、UGT2B4、BSEP基因表达上调，抑制胆汁淤积通路来保护肝细胞，但有剂量差异。

重组的脂联素调节肝细胞系L02基质金属蛋白酶-9表达及活性

目的观察重组脂联素对肝细胞系L02基质金属蛋白酶-9表达及活性的影响,探讨脂联素在肝纤维化中的作用。方法细胞分未转染对照组、转染空载体组、整合了adi-p EGFP-C1的L02细胞3组。体外扩增脂联素adiponectin mRNA全长,通过双酶切、插入及连接等基因克隆方法构建真核表达载体adi-p EGFP-C1。然后通过基因转染方法,将adi-p EGFP-C1转染到肝细胞系L02细胞中。通过G418压力筛选出adi-p EGFP-C1/L02稳定细胞系,用基因、蛋白以及蛋白酶谱等技术检测基质金属蛋白酶MMP-9的基因水平、蛋白水平以及酶的活性水平。结果 adi-p EGFP-C1构建成功,并成功筛选到L02稳定细胞系adi-p EGFP-C1/L02,与空白对照组相比,MMP-9mRNA表达水平上调(P<0.01),MMP-9蛋白水平和活性均上调(P<0.05)。结论脂联素通过调节MMP-9的表达及活性可能影响肝纤维化进程。

白藜芦醇对过氧化氢诱导的L02肝细胞氧化应激损伤的保护作用

目的观察白藜芦醇对L02肝细胞氧化应激损伤的保护机制。方法采用60μmol/L H2O2诱导L02肝细胞12 h后,成功建立L02肝细胞氧化应激模型。采用CCK8法测定白藜芦醇作用于L02肝细胞的安全剂量范围,选取白藜芦醇30μmol/L作为最佳干预剂量。实验分为3组,即正常组、模型组和白藜芦醇组,诱导成功后,采用生物试剂盒检测细胞内一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量的变化,运用Western blot法检测各组细胞沉默调节因子1(SIRT1)蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组NO和MDA含量显著增加(P<0.01),SOD、GSH-Px水平明显下降(P<0.01),SIRT1蛋白表达量明显下调(P<0.05)。与模型组组比较,白藜芦醇组NO和MDA含量显著降低(P<0.01),GSH-Px、SOD活性显著升高(P<0.05),SIRT1蛋白表达量明显上调(P<0.01)。结论白藜芦醇可以改善H2O2诱导的L02肝细胞氧化应激状态,其抗氧化机制可能与SIRT1蛋白的激活有关。

灯盏乙素拮抗硒对人肝细胞L-02毒性的研究

目的 研究灯盏乙素拮抗硒对人肝细胞株 L- 0 2毒性作用。方法 采用噻唑蓝 (MTT)法研究灯盏乙素和硒对 L - 0 2细胞生长的作用 ;倒置荧光显微镜观察细胞形态变化 ;测定丙二醛 (MDA )、巯基含量和总抗氧化能力等氧化还原相关生化指标。结果 0 .5 mm ol/ L 灯盏乙素与细胞作用 4 8h时达到促细胞生长最佳条件 ,且可以显著拮抗 1,5μm ol/ L硒对 L - 0 2细胞生长的抑制作用 ;灯盏乙素和硒共同处理的细胞与仅用硒处理的细胞相比 ,细胞损伤程度明显减轻 ,MDA含量显著降低 ,巯基含量及体系抗氧化能力均显著增高。结论 灯盏乙素通过抗脂质过氧化和提高细胞抗氧化能力拮抗硒对 L - 0 2细胞的毒性。

三七总皂甙对脂肪变性L02肝细胞TG水平及SREBP-1c mRNA表达的影响

目的观察三七总皂甙(PNS)对脂肪变性肝细胞的降脂作用及机制。方法采用50%小牛血清诱导L02肝细胞48 h建立L02肝细胞脂肪变性模型,分为模型组、自然恢复组、PNS低剂量组、PNS高剂量组,并设正常组。除模型组继续予含50%小牛血清的1640培养基培养外,余组均改予含10%小牛血清培养。PNS低、高剂量组分别予10、50μg/ml PNS作用。药物作用24 h后,油红O染色观察肝细胞内脂滴变化,全自动生化仪检测TG水平,RT-PCR法检测固醇元件结合蛋白-1c(SREBP-1c mRNA)表达。结果与自然恢复组比较,PNS各治疗组细胞内脂滴少于其他组,低剂量组更为明显;TG水平明显低于其他各组(P<0.05),低剂量组下降更为显著(P<0.01);SREBP-1c mRNA的表达量均有下降,低剂量组更为明显(P<0.05)。结论PNS能显著降低脂肪变性肝细胞内TG水平,减轻肝细胞脂肪变性;机制可能与下调SREBP-1c mRNA的表达有关。

苦参素对人肝正常细胞L02影响的实验研究

目的探讨不同浓度苦参素(OM)作用不同时间对人肝正常细胞L02的损伤作用或不良反应。方法体外培养人肝正常细胞L02;采用MTT法观察不同浓度的OM作用不同时间后观察肝正常细胞L02细胞形态变化及增殖的情况。结果倒置显微镜下观察:与阴性对照组相比较,OM作用时间在24h、浓度为0～2.0mg/ml时L02细胞的形态及数量无明显变化,当作用时间超过24h后,随着时间延长、浓度增加,OM实验组L02细胞收缩变小、与周围细胞分离、细胞核周围较多空泡样结构均越明显,细胞数量逐渐减少。MTT检测结果显示:①当作用时间在24h时,与阴性对照组相比较,OM浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml时对正常肝细胞L02的增殖无明显抑制作用(P>0.05),浓度为3.0mg/ml、4.0mg/ml、8.0mg/ml时对人肝正常细胞增殖有不同程度的抑制作用(P<0.05),其抑制率分别为8.48%、15.43%、51.72%;②OM 1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、8.0mg/ml各浓度组作用于L02细胞48h和72h的抑制率分别为18.79%、26.06%、27.58%、31.52%、76.36%和33.20%、38.53%、41.82%、55.61%、89.95%。与24h相比较,作用48h、72h对正常肝细胞的增殖有不同程度的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论 OM在低浓度短时间内对人正常肝细胞L02无明显损伤或不良反应,但随着浓度增加、作用时间延长对人正常肝细胞L02的增殖有不同程度的损伤或不良反应,且呈时间-剂量依赖性。

三七总皂甙对脂肪变性L02肝细胞甘油三酯含量及解耦联蛋白2 mRNA表达的影响

目的观察三七总皂甙(PNS)对脂肪变性L02肝细胞内甘油三酯(TG)含量及解耦联蛋白2(UCP2)mRNA表达的影响及机制。方法采用50%小牛血清诱导L02肝细胞48h建立肝细胞脂肪变性模型,采用MTT法测定PNS作用于脂肪变性肝细胞的适宜浓度,随后将其分为5组,模型组、自然恢复组、PNS低剂量组(10μg/ml)、PNS高剂量组(50μg/ml),并设正常组。药物作用24h后,油红O染色观察肝细胞内脂滴变化,全自动生化仪检测肝细胞内TG含量,运用RT-PCR法检测肝细胞内UCP2 mRNA的表达。结果与正常组比较,油红O染色示模型组肝细胞内橘红色脂滴明显增加,并出现脂滴融合现象,模型组TG含量明显升高(P<0.01)。PNS治疗24h后,PNS各治疗组与自然恢复组比较,肝细胞内TG含量均明显减少(P<0.05),以低剂量组下降更为显著(P<0.01);油红O染色显示,PNS低剂量组肝细胞内脂滴数减少最为明显。与正常组比较,模型组肝细胞UCP2 mRNA的表达明显上调(P<0.01);与自然恢复组比较,PNS各治疗组肝细胞UCP2 mRNA的表达量均有下降,以高剂量组下降具有显著性差异(P<0.05)。结论 PNS能显著降低脂肪变性肝细胞内TG含量,减轻肝细胞脂肪变性。UCP2 mRNA的高表达与肝细胞脂肪蓄积密切相关,PNS可能是通过下调UCP2 mRNA的表达来改善肝细胞的脂肪变性。

ZCWCC1蛋白在L02肝细胞脂肪变性中的表达变化

目的研究ZCWCC1蛋白在人L02肝细胞脂肪变性中的表达变化并探讨其机制。方法培养中加用500μmol/L的油酸处理L02肝细胞,建立肝细胞脂肪变性体外模型,采用油红染色评价脂质蓄积程度,采用免疫荧光及激光共聚焦显微镜观察ZCWCC1蛋白在L02肝细胞脂肪变性时的表达改变,以Western blot对其进行半定量评价,并使用赖氨酸蛋白酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺(N-Ethylmaleimide,NEM)及蛋白酶体抑制剂MG132对ZCWCC1蛋白表达变化的相关机制进行初步探讨。结果油红染色及细胞甘油三酯含量测定证明L02肝细胞脂肪变性体外模型成功建立,激光共聚焦显微镜观察发现ZCWCC1蛋白主要定位在胞核内,其荧光信号随油酸诱导时间延长而减弱,Western blot检测结果显示,ZCWCC1表达水平也随油酸诱导时间延长(0、3、6、12、24、48 h)而降低[(56 283±303)、(56 753±539)、(55 561±996)、(56 257±326)、(48 339±712)、(43 022±2 198),P<0.01]。NEM处理可使ZCWCC1降解增加,MG132处理可逆转ZCWCC1在L02肝细胞脂肪变性中的下降趋势。结论 ZCWCC1蛋白在L02肝细胞的脂肪变性过程中表达下降,可能与泛素-蛋白酶体途径有关。

何首乌及其主要成分对正常人L02肝细胞损伤作用的研究

目的考察比较何首乌及其主要成分(大黄素、大黄酸、没食子酸、儿茶素)对肝细胞损伤作用的差异。方法以正常人L02肝细胞系作为评价模型,考察何首乌及其主要成分对肝细胞抑制率及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响。结果 4 mg生药量/m L何首乌70%乙醇提取物作用L02细胞24 h的抑制率接近40%。相同浓度下,没食子酸、大黄酸及大黄素对肝细胞抑制率较高,儿茶素对肝细胞抑制率较低;大黄素、大黄酸对肝细胞的抑制率较没食子酸低;生化指标检测显示除AST外,没食子酸对其他生化指标影响均大于大黄素及大黄酸。结论在一定浓度范围内,没食子酸、大黄素及大黄酸对正常L02细胞具有细胞毒性,可能与何首乌的肝损伤有关;相同浓度下,没食子酸的肝毒性大于大黄素及大黄酸。

硒代蛋氨酸对肝细胞L02中硒蛋白表达的影响及丝氨酸的协同作用

目的观察硒代蛋氨酸对肝细胞L02硒蛋白表达的影响及丝氨酸的协同作用。方法培养L02细胞,分为硒代蛋氨酸组和丝氨酸+硒代蛋氨酸组。硒代蛋氨酸剂量设为0.001、0.01、0.1、1和10μmol/L,丝氨酸和硒代蛋氨酸按照2∶1摩尔比混合。作用于L02细胞48 h后,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)双抗体夹心法检测细胞培养上清液中硒蛋白P和裂解液中谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPx1)浓度,采用免疫印迹法检测裂解液中硒蛋白P和GPx1表达水平。结果硒代蛋氨酸浓度为0.1和1μmol/L时,硒蛋白P和GPx1表达分别达到拐点,硒代蛋氨酸浓度为10μmol/L时,GPx1和硒蛋白P表达下降。硒代蛋氨酸剂量为0.001~10μmol/L时,丝氨酸对细胞内GPx1和硒蛋白P表达具有协同作用。结论硒代蛋氨酸作用于人正常肝细胞L02时,硒蛋白合成出现拐点,且丝氨酸对硒代蛋氨酸在肝细胞L02内表达GPx1和硒蛋白P具有协同作用。

L02细胞在2-乙酰氨基芴处理大鼠肝中的增殖

目的:应用2-乙酰氨基芴(2-acetaminofluorene, 2-AAF),研究L02细胞移植到具有正常免疫性的大鼠肝内的存活与增殖情况．方法:SD大鼠出生前宫内ip正常人L02肝细胞,诱导胎鼠对L02肝细胞产生免疫耐受,出生2 wk时分别ip小(1．2 mg／kg)、中(13 mg／kg)、大剂量(30 mg／kg)2-乙酰氨基芴或生理盐水,隔日行2／3肝切除术,同时经脾移植DiI染色后的人L02肝细胞,建立2-AAF／PH肝细胞增殖模型．采用免疫荧光、RT-PCR、免疫组化、DiI荧光示踪等方法,在不同时相分别检测人白蛋白、人白蛋白mRNA、增殖细胞核抗原(PCNA)以及在荧光显微镜下观察人L02肝细胞在鼠肝内的分布,并采用计算机图像分析系统分析不同时相PCNA阳性细胞的数密度和面积密度．结果:2-乙酰氨基芴实验组(小、中、大剂量)的各项检测,均与对照组无明显区别;于移植后1,2,4,6,8,10 wk在荧光显微镜下观察到人L02肝细胞在鼠肝内的动态分布;移植后2, 4,6,8 wk大鼠均检测出人白蛋白及人白蛋白mRNA;移植后2,4,6 wk检测出特异性人增殖细胞核抗原PCNA,移植后1,2,4,6,8 wk检测出非特异性PCNA．结论:2-AAF／PH模型中,2-乙酰氨基芴对移植L02细胞无明显增殖作用;L02细胞在2-乙酰氨基芴处理人鼠嵌合肝动物模型中存活10 wk,产生白蛋白功能持续8 wk．

NADH对辐射诱导正常肝细胞株L02损伤时细胞凋亡的影响

目的研究抗氧化剂NADH对5.0 GyX射线照射正常细胞的防护作用.方法处理组于5.0 Gy X射线照射后立即加入NADH,一次给药,剂量为100～600 μg/ml,分别观察培养6、12、24 h后凋亡细胞率及p53和Bcl-2蛋白表达,并且与照射后加入RPMI 1640组和假照射组比较.结果NADH抑制细胞凋亡率呈剂量依赖性,在浓度为400～600 μg/ml时达平台,并且能够上调Bcl-2蛋白表达,下p53蛋白表达,差异非常显著(P＜0.01).结论NADH对受照L02肝细胞有明显的防护作用,但其作用机制还需进一步研究.

全氟辛烷磺酰基化合物致人肝L-02细胞的凋亡作用

目的研究全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)致人肝L-02细胞的凋亡作用及凋亡相关基因bax、bcl-2、caspase-9和caspase-3 mRNA表达的变化。方法当L-02细胞处于对数生长期时,分别加入不同浓度(0、50、100、200、400μmol/L)的PFOS处理24、48和72 h,MTT试验检测细胞的生存率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测bax、bcl-2、caspase-9和caspase-3 mRNA的水平。结果PFOS能抑制L-02细胞的增长,诱导细胞凋亡,并伴随bax、caspase-9和caspase-3 mRNA水平的升高和bcl-2 mRNA水平的下降。当400μmol/L PFOS处理L-02细胞48 h,bcl-2、bax、caspase-9和caspase-3分别是对照组的0.25、3.90、3.53和2.91倍,细胞凋亡率由对照组2.7%上升至24.3%。结论PFOS能抑制L-02细胞的生长,诱导细胞凋亡,其分子机制可能是上调bax、caspase-9、caspase-3基因和下调bcl-2基因的表达。