基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法的Ddx3x肝脏条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法对F0代和F1代小鼠进行基因鉴定。将Ddx3x-flox F1代小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏条件性敲除Ddx3x基因小鼠(Ddx3x^(Δhep))。采用PCR方法和Western blotting方法分别检测Ddx3x^(Δhep)基因小鼠目的基因与蛋白的表达。选取8周龄雄性野生型C57/6J小鼠、Ddx3x^(Δhep)小鼠、Ddx3x^(fl/fl)小鼠,测定血清ALT、AST水平评价肝脏肝损伤情况。结果对F1代小鼠基因PCR鉴定的结果表明,基因型符合Ddx3x^(fl/fl);F1代小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代与Ddx3x^(fl/fl)小鼠杂交,即获得Ddx3x^(Δhep)小鼠;PCR与Western blotting结果显示,目的小鼠肝组织中Ddx3x基因和蛋白表达显著降低。此外,Ddx3x^(Δhep)小鼠无胚胎致死现象,出生后生理状况良好。正常饲养条件下,Ddx3x^(Δhep)小鼠与Ddx3x^(fl/fl)小鼠及野生型小鼠相比,血清ALT、AST指标及体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法成功构建了Ddx3x^(Δhep)小鼠动物模型,为后续研究Ddx3x在肝脏中的生物学功能及作用机制奠定了良好的基础。