肝脏组织工程学中的胚胎干细胞

肝脏组织工程是新近兴起的一门学科 ,其目的是经过培养形成有独立代谢功能的肝脏器官。其中 ,种子细胞来源是关键 ,胚胎干细胞由于不存在来源短缺及异种排斥问题 ,是理想的选择 ,现在许多学者进行了由胚胎干细胞向肝细胞的转化研究 ,并与人工材料 ,基因调控等技术结合 ,取得了显著的进展 ,这些研究解决了许多理论和实践上的问题 。

基于脱细胞技术的肝脏组织工程研究进展

我国是肝病大国,是肝癌、肝硬化、重症肝炎等因素导致终末期肝病的高发地区。目前唯一有效的治疗手段仍然是原位肝脏移植。除外费用昂贵、免疫排斥、术后并发症等问题的限制,肝脏供体的稀缺使得大多数患者在等待器官移植的过程中死亡。

基于专利分析看肝脏组织工程领域的竞争态势

背景:中国是肝病高发国家,肝脏组织工程为治疗带来了新的希望,但目前此技术仍处于探索阶段。目的:对肝脏组织工程领域的专利进行分析,揭示全球技术竞争态势,为中国肝脏组织工程的发展与创新提供借鉴和参考。方法:对近20年肝脏组织工程领域的专利数量与发展趋势、技术发源地、目标市场、申请机构、发明人和技术分布等进行分析,全文检索关键词包括组织工程(tissueengineering)、组织修复或组织再生(tissue regenerate/repair)和肝(hepatic/liver)等。检索截止时间为2018年12月28日。结果与结论:①全球肝脏组织工程领域发展速度较快,近10年复合增长率8.64%,其中发明专利占84.93%。②中国是全球肝脏组织工程最主要的技术发源地。但三方专利数量远不及美国和日本。③中国和美国是肝脏组织工程领域的最受关注的两大目标市场,但申请人多集中于本国,国际授权数量较少。④在专利权人和发明人排名中,中国分别有8家机构和14位申请人跻身全球前20。⑤结果证实,从专利分析结果来看,中国肝脏组织工程技术发展迅猛,跻身国际前列,但缺乏核心技术,各研发主体还应不断提升创新能力,挖掘高价值技术,从而提高国际竞争力。

三维脱细胞肝脏组织工程支架的评价及优化

目的验证脱细胞肝脏细胞外基质的生物相容性，优化研制的肝脏组织工程支架及培养条件。方法将人肝癌细胞系——HepG2细胞以1×105细胞／cm。的密度种植在六种不同脱细胞肝脏细胞外基质支架上，分别在静置和动态条件下（10r／min）培养12d。结果种植在六种不同脱细胞肝脏细胞外基质支架上的HepG2细胞都显示了明显的细胞增殖。HepG2细胞种植12d后，与其他方法比较，水洗法处理的细胞外基质支架细胞增殖明显增加（P〈0．05）。动态培养条件下，HepG2在细胞外基质表面均匀生长，形成5—6层，并且细胞向基质内部生长4—6层。结论我们研究制备的肝脏细胞外基质具有良好的生物相容性，优化了脱细胞方法和培养条件。

脱细胞技术及其在肝脏组织工程中的应用

肝移植是目前治疗终末期肝病的唯一有效方法,供体来源短缺、器官排斥、长期使用免疫抑制剂导致的毒性以及继发感染等问题限制了其临床应用。以脱细胞方法为基础的肝脏组织工程在近年取得了较大发展,成为最有希望克服上述困难并发挥肝脏功能的有效方法。本文对脱细胞技术及其在肝脏组织工程中应用的最新进展进行了综述。

基于脾脏脱细胞支架构建组织工程肝脏的体内植入策略

目的体外构建基于脾脏脱细胞支架的组织工程肝脏,并探索其理想的体内植入策略。方法获取健康SD大鼠脾脏,采用低温冻融结合十二烷基硫酸钠灌注法制备脾脏脱细胞支架(DSM)。Seglen改良两步胶原酶灌注法获取大鼠原代肝细胞,经脾动脉再植入DSM内体外构建组织工程肝脏。以SD大鼠为受体,比较异位血管吻合移植、肝断面缝合移植、肝内嵌入移植以及肠系膜包裹移植4种策略的优缺点。结果肝细胞支架种植率为(74.5±7.7)%,HE染色与扫描电镜显示细胞状态良好,免疫荧光染色证实细胞正常表达ALB、G6Pc。异位血管吻合移植手术难度高,围手术期死亡率高达33.3%,术后6 h支架内形成大量血栓;肝断面缝合无法迅速建立充分血供,术后3 d未见成形移植物;肝内嵌入移植法细胞最长可存活14 d;肠系膜包裹移植术后14 d时支架内细胞存活率为(38.3±7.1)%。结论利用DSM构建的组织工程肝脏能部分表达肝细胞特异性功能,肠系膜包裹移植策略简单安全有效,是目前可行的体内移植方式。

组织工程肝脏研究的相关问题

1.组织工程肝脏和生物人工肝的关系？目前的组织工程肝脏和生物人工肝都是基于肝细胞的治疗方式，利用肝细胞的功能部分代偿肝脏功能，因此两者在技术上有很多共通之处。不同点在于生物人工肝的肝细胞置于生物反应器中，为体外应用，主要利用肝细胞的解毒功能；组织工程肝脏的肝细胞则是直接植入体内，

3D生物打印技术用于肝组织模型构建的研究进展

3D生物打印是以活体细胞、生物材料和活性分子为原料,制造仿生结构模型的一种新兴技术。在肝脏组织工程领域,3D生物打印技术能构建具有生物活性与功能的肝组织模型,用于肝脏疾病治疗与再生医学研究。本文就3D生物打印技术用于肝组织模型构建的相关研究进展作一综述。

杞黄葛复方对组织工程肝脏非酒精性脂肪性肝病模型的肝脏保护作用研究

目的借助新型组织工程人工肝脏非酒精性脂肪性肝病模型,探讨杞黄葛复方对肝脏组织细胞氧化应激、脂肪酸代谢的影响。方法取大鼠肝脏,去细胞后加入人HepG2细胞制备组织工程肝脏。再细胞化完成后,实验分为3组:正常组用完全培养基培养;模型组用高脂培养基培养;杞黄葛复方组用高脂培养基培养,于第6天同时灌注100μg/mL的杞黄葛复方培养3 d。3组均于第8天培养结束收集细胞。采用CCK8法检测不同浓度(1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1 mg/mL)的杞黄葛复方浓缩液干预后肝细胞存活率;按照试剂盒说明检测正常组、模型组和杞黄葛复方组HepG2细胞中三酰甘油(TG)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;采用RT-qPCR检测模型组和杞黄葛复方组HepG2细胞中肝脏脂质合成途径相关酶[酸转位酶(CD36)、载脂蛋白B(ApoB)、脂肪酸合酶(FAS)、ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、脂肪酸去饱和酶2(FADS2)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸结合蛋白1(FABP1)]和转录因子[过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)]mRNA表达情况。结果杞黄葛复方各浓度组高脂培养的人HepG2细胞存活率与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。模型组HepG2细胞中TG、ROS、MDA含量均明显高于正常组(P<0.05),SOD含量明显低于正常组(P<0.05);杞黄葛复方组HepG2细胞中TG、ROS、MDA含均明显低于模型组(P<0.05),SOD含量明显高于模型组(P<0.05)。杞黄葛复方组HepG2细胞中CD36、FAS、ACLY、FADS2、ACC、FABP1、PPARγmRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),ApoB mRNA相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论杞黄葛复方可以通过下调肝脏脂质合成途径相关酶和转录因子的表达抑制游离脂肪酸的摄取,减少TG合成;可以通过减少ROS、MDA产生和提高SOD活性而增强细胞抗氧化能力,从而保护肝脏。

让昨天告诉今天:组织工程肝脏研究的学术与技术进展

组织工程肝脏研究成果按时间年限的导读：1888年，英国学者Carl Langenbuch首先成功施行了肝左叶切除治疗。1963年，美国医生Tohmas E Starzl为先天性胆道闭锁的3岁男孩施行了首例肝移植手术。1963年，美国学者Nose教授等在成功通过血液透析系统治疗肾功能衰竭50年后，首次报道一种替代肝脏合成和代谢功能的装置，

去细胞化肝脏生物支架材料的制备

目的探讨制备去细胞化肝脏生物支架(decellularize d liver biological scaffold,DLBS)的新方法,寻找适合肝脏组织工程的新型支架材料。方法 (1)采用化学去垢剂—酶联合去细胞化技术制备去细胞化全肝脏生物支架,并观察去细胞化效果;(2)DLBS与C3A及骨髓间充质干细胞体外共培养,观察DLBS细胞相容性。(3)通过四氮唑盐比色法(MTTAssay)观察DLBS对C3A的增殖作用。(4)将DLBS植入SD大鼠背部皮下,4周后处死大鼠,观察鉴定DLBS的组织相容性。结果通过HE染色、扫描电镜观察证实经过化学去垢剂—酶联合去细胞方法制备的去细胞化全肝生物支架不含细胞成分,只剩下胶原、弹性蛋白等支架成分;体外培养实验发现,L02及骨髓间充质细胞能够与DLBS粘连、生长。MTTAssay检测证实DLBS有促进C3A生长、增殖的作用。结论利用化学去垢剂—酶联合去细胞化技术制备的DLBS脱细胞彻底、细胞外基质保留较完整,并且有促进细胞粘附、增殖和分化的作用,是一种较为理想的生物支架材料。

选择适宜的灌注去细胞方法应用于全肝脏去细胞支架的制备

目的对比低浓度十二烷基硫酸钠(SDS)和1%Triton X-100对制备大鼠肝脏去细胞支架(DLBS)的影响,建立一种简单且适宜的DLBS的制备方法。方法将低浓度SDS(0.25%、0.50%)和1%Triton X-100分别加入大鼠肝脏去细胞流程,通过免疫荧光及扫描电子显微镜观察支架结构,并对支架内成分进行定量分析,再通过四氮唑盐比色法(MTT,Assay)观察支架对C3A的细胞毒性。结果 0.25%SDS和0.50%SDS处理组的DNA定量均小于50ng/mg干质量,并且糖胺聚糖在0.25%SDS和1%Triton X-100处理组的定量要高于0.50%SDS处理组。同时,MTT实验表明3种方法处理后的去细胞支架对于C3A细胞的生长无毒性作用。结论应用0.25%SDS在5mL/min灌注流速下去细胞能够制备更为理想且有效的DLBS,从而为器官再生打下基础。

肝脏类器官构建方式的研究进展

肝移植作为目前终末期肝病(end stage liver disease,ESLD)的唯一治疗手段,因为供肝相对短缺、有相当一部分患者未能得到及时的治疗,因此开发新的替代性治疗方式对于ESLD治疗具有重要的意义。类器官是组织工程肝脏的一个主要方向,构建的组织在结构和基因表达方面与靶器官有明显的同源性,且功能相似,在进行原位或异位移植后能发挥治疗作用。本文就近年来几种主要肝脏类器官构建方式的研究进展作一综述。

以胶原水凝胶为支架构建肝细胞三维培养系统

背景:肝细胞体外培养时快速失去功能限制了肝细胞疗法的发展。目的:以胶原水凝胶为支架建立能够长时间有效维持肝细胞功能的肝细胞三维培养系统。方法:将SD大鼠肝细胞与预混肝细胞生长因子及DMEM的液态Ⅰ型胶原混合,形成肝细胞/胶原凝胶复合物,将该复合物接种至培养板,待形成胶冻状凝胶后再加培养液进行培养。通过光学显微镜、苏木精-伊红染色及透射电子显微镜对肝细胞的形态学特征及超微结构进行观察;并通过糖原染色、免疫荧光染色、实时定量PCR进一步对肝细胞特异表型及功能进行检测。收集培养上清,检测细胞白蛋白及尿素合成能力。结果与结论:①肝细胞/胶原水凝胶复合物形成后,可见肝细胞呈圆形分布于水凝胶中,培养14d后仍保持肝细胞形态并呈类似肝脏结构的肝索样聚集排列,超微结构观察显示肝细胞之间形成紧密连接。②培养14d后,糖原染色、白蛋白及肝细胞核因子4α免疫荧光染色呈阳性,证实肝细胞具有糖原及白蛋白合成能力并仍具有分化潜能。③三维培养中,肝细胞的白蛋白及尿素合成能力及分泌水平明显高于二维培养,且至少能够在较高水平维持15d。④培养7d后,Albumin、HNF-4α、Claudin-3、CYP1A1、CYP3A1以及G6P等肝细胞特异性基因的表达水平明显高于二维培养。以上结果证实,以胶原水凝胶为支架构建的三维培养系统使肝细胞在结构上更类似肝脏组织,并能在更长时间内有效的维持肝细胞合成代谢等各方面功能。

鼠胚胎肝细胞在体外L-聚乳酸支架上的长期培养及其成熟化诱导

目的 研究三维生物降解材料 L-聚乳酸 (PL L A)对胚胎肝细胞的支持作用及制瘤素 M(OSM)、尼克酰胺 (NA)和二甲亚砜 (DMSO)在胚胎肝细胞成熟化中的作用 ,探讨胚胎肝细胞在肝脏组织工程中应用的可行性。方法 将两步法分离获得的 E14 .5 - C5 7BL/6 Cr Slc小鼠胚胎肝细胞接种于具有三维立体多孔结构的 PL L A支架后 ,在含有及不含有 OSM、NA和 DMSO的 Williams'E条件培养基中进行原代长期培养 ,了解其增殖能力、形态及功能变化。 结果 与单层培养相比 ,三维立体 PL L A支架培养胚胎肝细胞其细胞数量与白蛋白的分泌量均明显增加 ;单层培养中 ,单独添加 OSM组白蛋白分泌仅有轻微增加 ,但 PL L A培养中 OSM组的胚胎肝细胞白蛋白分泌量明显增加 ;无论是单层培养或 PL L A培养 ,OSM/NA/DMSO组白蛋白分泌均明显增加。 结论 三维 PL L A支架是胚胎肝细胞培养的良好支持物 ;OSM、NA和 DMSO可明显促进肝脏实质细胞在体外的成熟。

冷保存方法构建的大鼠肝移植模型

背景:肝移植是终末期肝病最为有效的治疗手段,移植后胆病是制约肝移植发展的主要障碍之一。目的:建立稳定的大鼠冷保存肝移植模型,探讨冷保存对肝移植后肝脏胆管的影响。方法:120只雄性SD大鼠随机分为4组,按照组内随机配对的原则,体质量相对较轻的大鼠做为供体,供肝置于4℃UW液中分别保存2,8,16h后行原位肝移植。在"两套袖法"基础上,以"支架法"建立动脉化大鼠原位肝移植模型,供受体肝总动脉采用改良"支架法"进行端端吻合,重建肝动脉血供。记录移植手术时间及移植成功率,并分别于移植后3,7d检测血清转氨酶、总胆红素、碱性磷酸酶水平,同时观察组织病理学改变。结果与结论:实验共完成55例次大鼠原位肝移植手术,手术成功率为93%。冷保存2,8,16h组术后7d存活率分别为100%(9/9),83%(10/12),73%(8/11)。随着冷保存时间的延长,肝功能及肝内胆管损伤加重,胆管组织病理学评分显示各组间差异有显著性意义(P<0.05)。其中供肝冷保存16h大鼠肝移植模型既有较高的手术存活率又有严重的胆管损伤,是研究冷保存对肝移植胆管病影响的较好模型。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养新方法

目的探讨一种新的小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养方法。方法分离小鼠3 d乳鼠双后肢,剔除肌肉筋膜组织,剪碎后接种于含10%胎牛血清的α-MEM中,观察细胞形态学变化,采用CCK8检测细胞增殖能力,绘制细胞生长曲线,采用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原,并进行多向分化潜能鉴定。结果原代分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞呈长梭形,从骨片周围爬出,传代后,细胞形态一致,生长良好;绘制的细胞生长曲线呈"S"型,流式细胞表型鉴定结果显示,培养的细胞高表达CD90、CD29,低表达CD11b、CD45,成脂油红O染色和成骨茜素红染色均呈阳性。结论采用小鼠3 d乳鼠骨片法能够成功培养出骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞可作为肝脏组织工程的种子细胞。

大鼠骨髓间质干细胞与两种壳聚糖支架相容性的对比实验研究

目的:对比研究大鼠骨髓间质干细胞(BMSC)与半乳糖化壳聚糖支架的和壳聚糖支架相容性,为未来肝脏组织工程寻求理想的种子细胞载体。方法:制备半乳糖化壳聚糖和壳聚糖支架,体外分离培养大鼠BMSC,将大鼠BMSC接种于这两种支架内进行体外培养,扫描电镜观察显微结构,采用MTT法及荧光显微镜观察大鼠BMSC在两种壳聚糖支架上的生长情况,并进行比较。结果:扫描电镜显示BMSC在这两种支架内均呈球形方式生长,MTT法和荧光显微镜显示BMSC在壳聚糖支架与半乳糖化壳聚糖支架均能很好地黏附、生长和增殖,MTT法显示细胞接种后10、13、16、19、22d半乳糖化壳聚糖组OD值明显高于壳聚糖组(P<0.05),细胞接种后14d荧光显微镜下显示半乳糖化壳聚糖支架上的细胞数量明显多于壳聚糖支架(P<0.05)。结论:大鼠BMSC与壳聚糖支架及半乳糖化壳聚糖支架均具有良好的相容性,BMSC在半乳糖化壳聚糖支架上能更好地黏附和生长,半乳糖化壳聚糖支架可望成为未来肝脏组织工程的良好的种子细胞载体。

生物制造技术及发展

自20世纪90年代西安交通大学机械工程学院提出生物制造的概念,提出以工程方法解决医学问题以来,在20多年与医学、材料和生物学等学科专家的密切合作中,已在骨与关节、肝脏、肠道、大脑等器官的人工内植入物研究上取得了进展。重点介绍和总结了定制化人工假体、活性人工骨和关节以及组织工程化肝脏等制造技术的研究工作与成果,探索其中的问题与发展前景。