草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

俄罗斯鲟肝脏表达抗菌肽2基因的分子特征及抗菌活性分析

肝脏表达抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide 2,LEAP-2)在鱼类先天免疫系统中发挥重要作用。本研究通过RACE技术获得了俄罗斯鲟LEAP-2(Acipenser gueldenstaedti LEAP-2,AgLEAP-2)的全长c DNA序列,对其序列特征和表达水平进行了分析;构建Ag LEAP-2原核表达载体并对重组蛋白进行纯化;进一步采用琼脂稀释法初步检测Ag LEAP-2蛋白的抑菌活性。结果显示,AgLEAP-2基因c DNA全长为622 bp,开放阅读框(ORF)为246 bp,预测编码81个氨基酸,分子量约为11.2 kDa,5′端非编码区为184 bp,3′端非编码区为192 bp。Ag LEAP-2包含一个信号肽(1~25 aa)和一个成熟肽(26~81 aa),成熟肽含有4个保守的半胱氨酸残基,在Cys58-Cys69和Cys64-Cys74的相对位置之间各形成一个二硫键的核心结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,AgLEAP-2在所有健康组织中广泛表达,在肝脏中表达水平最高,在肠道和肌肉中表达水平次之,在鳃中表达量最低。与0 h相比,Ag LEAP-2在感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后的不同时间点的肝脏、脾脏、肠道、头肾、鳃和血液组织中均显著上调。此外,重组Ag LEAP-2蛋白(r Ag LEAP-2)在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性并存在剂量效应。本研究表明,AgLEAP-2可能在俄罗斯鲟的先天免疫系统中发挥重要作用且对多种病原菌有一定的抗菌效果,本研究为开发新的抗菌制剂提供了依据。

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏表达的抗菌肽-2(LEAP-2)在E.coli中的融合表达

抗菌肽是存在于生物细胞中的一类具有强抗菌作用的天然小分子多肽,它们在机体免疫系统中发挥了重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。本文通过RT-PCR法从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的肝脏中分离到抗菌肽-2(LEAP-2)基因,该基因编码94个氨基酸残基组成的多肽;氨基端的信号肽由28个残基组成,成熟肽含有41个残基;对于鱼类和哺乳动物显示高度保守的4个半胱氨酸残基位于多肽的羧基端区域。通过对LEAP-2基因添加EcoRI和HindIII酶切位点和对pET32a进行双酶切处理,成功构建了"pET32a-IpL-2"重组表达质粒,并转化工程菌E.coliBL21(DE3)。在工程菌对数生长后期加入诱导剂IPTG、经25℃培养后,可溶性的"trxA-IpL-2"融合蛋白得到高程度的表达。Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析表明,获得了高纯度的目的蛋白。

乌苏里白鲑肝脏表达抗菌肽Leap-2基因的克隆及细菌感染后的组织表达分析

为探究乌苏里白鲑Coregonus ussuriensis Berg肝脏表达抗菌肽Leap-2基因的分子结构和表达特征,采用PCR技术从乌苏里白鲑(体质量为30.0 g±1.2 g)肝脏组织中扩增Leap-2基因的开放阅读框(ORF),使用生物信息学软件对其编码的氨基酸序列进行分析,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在健康组织及嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus感染后的组织表达变化。结果表明:采用PCR方法从乌苏里白鲑肝脏中克隆得到Leap-2基因的ORF区(GenBank:MZ170050),片段长度为276 bp,可编码91个氨基酸,其成熟肽区域包含4个高度保守的半胱氨酸残基;系统进化分析显示,乌苏里白鲑的Leap-2氨基酸序列与银鲑Oncorhynchus kisutch的亲缘关系较近,且具有较高的同源性,一致性为96.7%;乌苏里白鲑肝脏中的Leap-2基因表达量最高,其次为肠和肾,肌肉中的基因表达量最低;3种细菌感染导致Leap-2在各组织中的表达均有所上调,Western blot检测也显示,Leap-2蛋白水平在24 h内表达上调。研究表明,Leap-2基因参与了乌苏里白鲑应对外源干扰的免疫反应,本研究结果可为解析乌苏里白鲑应对病原体的免疫应答机制提供科学参考。

日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽2基因的克隆与表达

为探讨鱼类抗菌肽基因的生物学功能,研究应用RACE方法克隆获得了日本鳗鲡(Anguilla japonica)肝脏表达抗菌肽2基因(Liver-Expressed Antimicrobial Peptide 2,LEAP-2),即AJLEAP-2的cDNA序列,全长为450 bp,开放阅读框编码89个氨基酸。其成熟肽含有LEAP-2保守基序"C-X5-C-X4-C-X4-C"。AJLEAP-2基因组结构与其他脊椎动物LEAP-2相同,都包含有三个外显子。利用荧光定量PCR检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡不同组织/器官中的表达,发现其转录子在肝脏中表达量最高,是内参基因(β-acHn)的6倍;其次是肠道,但其表达量仅为肝脏的1/130。此外,还检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡玻璃鳗(Glass eel)阶段的转录表达水平,结果显示,玻璃鳗中AJLEAP-2的转录表达量仅低于黑仔期的肝脏,为黑仔鳗肠道表达量的2倍。LPS和迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)刺激能显著上调鳗鲡血液中AJLEAP-2的转录表达,刺激16h后上调倍数最高,分别为对照组的86倍和12倍。此外,LPS刺激72h和E tarda刺激8h后,肠道中AJLEAP-2显著上调表达(P<0.05),为对照组的8倍。Poly I:C刺激24h后,血液中AJLEAP-2转录表达显著下调。结果表明,AJLEAP-2在日本鳗鲡抗细菌感染过程中起重要的作用。

肝脏表达的抗菌肽-2

抗菌肽是在多种生物体中表达的具有抗菌活性的肽类物质的总称。肝脏表达的抗菌肽-2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)在肝脏中产生后分泌到血液中参与血液循环,从而发挥抗菌活性等作用。本文简要介绍LEAP-2的发现过程,对LEAP-2的基因组成、结构、诱导表达机理、抗菌活性以及基因调控等方面的研究进行综述,并展望LEAP-2可能的生理功能。

鸡Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表达及抑菌研究

为了研究鸡Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的体外表达产物的活性,试验进行了肝脏样品无菌采集,基因的克隆及密码子优化和表达,以表达产物对致病菌做纸片法药敏试验,判断其抑菌作用。结果表明,试验经低温处理获得了较好的肝脏总RNA,克隆并优化了鸡LEAP-2基因;经诱导得到了表达产物,形式为包涵体;抑菌试验表明,表达产物对16株分离致病菌具有抑制作用。

1,25-(OH)_2-D_3对抗菌肽表达调控的影响

通过外源途径调控机体内源性抗菌肽表达,以增强动物的防御能力和提高动物的生产性能是实现"健康养殖"的一条新型途径。生物体受病原微生物入侵后可由TLR介导内源性抗菌肽表达。结果表明:由PAMP诱发抗菌肽合成机制的模式有TLR-NF-κB和TLR-VDR 2大信号传导通路。TLR-VDR通路的基本过程是激活相应TLR→诱导Cyp27B1表达→产生1,25-(OH)2-D3→激活VDR→识别抗菌肽基因VDRE序列而调节抗菌肽表达。1,25-(OH)2-D3作为TLR-VDR通路的重要调节物质,可诱导抗菌肽在许多细胞中表达并与其他物质对抗菌肽表达起协同作用。

鸡内源性抗菌肽LEAP-2的生物信息学分析

为了解鸡内源性抗菌肽LEAP-2的基本信息,根据鸡LEAP-2的氨基酸序列,通过软件对鸡LEAP-2的生物信息学进行分析。结果表明,鸡LEAP-2由20种氨基酸构成,等电点为9.86,分子量为8 835.65 u,为不稳定的疏水蛋白,定位于细胞核内,有1个跨膜区和1个信号肽,有2个糖基化位点和8个磷酸化位点,二级结构由α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲组成,三级结构和功能结构域类似于人LEAP-2,存在多个抗原表位,根据系统进化树推测,鸡LEAP-2与日本鹌鹑LEAP-2进化关系最近。研究结果为鸡抗菌肽LEAP-2的深入研究提供了信息基础。

大黄鱼肝表达抗菌肽2基因的克隆和原核表达

抗菌肽是在多种细胞中表达具有抗菌活性的肽类物质的总称,在免疫反应中发挥着非常重要的作用。通过同源克隆法克隆到大黄鱼肝脏表达的抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)基因的完整开放阅读框(Opening Reading Frame,ORF)。克隆到的大黄鱼LEAP-2全长2236 bp,包含外显子Ⅰ78 bp,内含子Ⅰ880 bp,外显子Ⅱ179 bp,内含子Ⅱ1044 bp,外显子Ⅲ55 bp,编码序列312 bp,编码103个氨基酸。推断的氨基酸序列羧基端区域存在高度保守的4个半胱氨酸残基,符合LEAP-2超家族的结构特征。同源性对比后显示LEAP-2基因在进化上高度保守,大黄鱼LEAP-2推断的氨基酸序列与牙鲆、黄颡鱼、蓝色鲶鱼和斑点叉尾鮰等鱼类之间的同源性均在95%以上。将大黄鱼LEAP-2 cDNA连接到pET-32a(+),构建了重组表达质粒pET-32a-LEAP-2,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/L IPTG诱导表达,获得了大小约为27 kDa的重组蛋白,与预期的一致。

人抗菌肽HBD-2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

制备人β-防御素2(HBD-2)多克隆抗体,以用于HBD-2蛋白水平表达的检测。提取人肠腺上皮细胞株Caco-2总RNA,设计引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HBD-2成熟肽cDNA片段,以pGEX-1λT为载体,构建原核表达质粒pGEX-1λT-HBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,并用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,ELISA法显示抗血清对HBD-2的效价为1∶12800,Western印迹显示抗血清可识别HBD-2。本实验结果证明应用重组融合小肽代替白蛋白或甲状腺-肽偶联免疫可获得其高效价的识别HBD-2的多克隆抗体,为今后从蛋白质水平研究HBD-2基因的诱导表达,包括组织分布和基因表达调控等研究打下了基础。

人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表达

为了获得高效表达的抗菌肽D2A21,本研究根据抗菌肽D2A21的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱的密码子,设计并人工合成D2A21基因,并将该合成基因克隆至pProEXHTb载体中,构建成含有含6个组氨酸标签的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌中,经摇瓶发酵,IPTG诱导后,发酵液用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明,成功合成D2A21基因,并构建了抗菌肽D2A21表达载体。通过镍柱亲和层析纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,抗菌肽D2A21能够在大肠杆菌中稳定表达。本研究将为大规模表达纯化D2A21及其进一步的研究和利用提供一定基础。

重组牛LAP-CATHL2融合抗菌肽的克隆及原核表达

从牛舌鳞状上皮细胞和股骨骨髓细胞中分别克隆出牛β-防御素LAP和牛CATHL2抗菌肽,然后利用重叠延伸PCR克隆得到重组牛LAP-CATHL2抗菌肽,将其克隆进pGEX-4T-1载体,构建了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽的原核表达载体,并转进感受态大肠杆菌BL21进行诱导表达,并加以纯化,得到了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽产量是2.83 mg·mL-1培养液。

猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因的真核表达及表达产物的抗菌活性研究

为获得猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因并研究其抗菌功能,根据CecropinP2成熟肽的编码基因,人工合成3条寡聚核苷酸片段,经PCR获取Cecropin P2基因序列,成功构建了重组表达质粒pPIC9 K-Cecropin P2-His6并转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化子经MD、MM以及G418筛选,1%甲醇诱导表达,利用Tris tricine-SDS-PAGE对表达产物进行检测。体外抑菌试验表明,获得的重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。本试验为抗菌肽的应用和新抗菌肽类药物的开发提供了必要的试验基础。

丁酸钠对IPEC-J2细胞抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响

选用不同浓度的丁酸钠对体外培养的IPEC-J2进行刺激试验,利用实时荧光定量PCR从mRNA水平研究不同浓度丁酸钠对仔猪空肠上皮细胞后PR-39基因表达的影响,以期研究丁酸钠对仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)PR39表达的调控作用。试验结果表明,丁酸钠对PR-39基因具有调控作用,随着丁酸钠浓度的增加,PR-39 mRNA的表达呈现先上升后下降的趋势。

一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。

共表达猪IL-2与融合抗菌肽重组质粒的构建及其小鼠免疫效应研究

为研制新型高效安全的动物免疫调节剂,本实验采用In-fusion克隆技术、2Aself-cleavage技术构建pVAX1融合抗菌肽与白细胞介素2基因真核共表达载体:CAM PS-2A-IL2(VAP2)。构建的重组质粒用壳聚糖包裹并转染HEK293细胞,通过猪外周血淋巴细胞刺激实验检测表达上清活性。将包裹的重组质粒纳米颗粒腹腔注射接种4周龄的雌性昆明小鼠作体内生物学活性研究。并于28d后用大肠杆菌(Amp、Kana高耐受)和金黄色葡萄球菌(Amp、Kana高耐受)进行攻毒试验,观察每组小鼠的发病率和死亡率。实验结果表明VAP、VAP2两实验组CD^(4+)、CD^(8+)细胞,IgG,IgG1,IgG2a含量以及TLR s,IFN-r等免疫相关因子的表达水平均明显高于对照组pVAX1(P<0.05)。而且两实验组相比较,VAP2组明显高于VAP组(P<0.05)。以上实验结果表明,CS包裹的VAP,VAP2能有效防止病原微生物感染小鼠,增强机体的体液免疫和细胞免疫能力,并且VAP2的作用要明显优于单一抗菌肽融合基因,表明抗菌肽融合基因与白细胞介素2的共表达对动物有更好的保护效应,这为研究新型有效的免疫分子以增强机体对感染的抵抗力奠定了基础,具有重要的学术价值和应用。

小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达

实验利用已构建的分泌型重组表达质粒pPIC9-mmLEAP-2,氯化锂转化表达宿主菌GS115毕赤酵母;应用表型和PCR技术筛选高拷贝转化株。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE分析重组mmLEAP-2表达量,为进一步研究mmLEAP-2的活性奠定了基础。

黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin(AS-hepc2)的前体肽和成熟肽cDNA序列,片段大小约250bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC9K质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2.电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120h达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.

LEAP-2和Ghrelin在代谢相关疾病的研究进展

肝表达抗菌肽-2(LEAP-2)最近被发现是生长激素促分泌素受体1α(GHSR1α)的内源性配体,可拮抗胃促生长素(Ghrelin)的激活作用,后续发现还可以反向激动GHSR1α,降低GHSR1α的基础活性。这种拮抗关系,不仅在调节生长激素分泌方面发挥关键作用,还在调节食物摄入、肥胖、葡萄糖稳态等复杂功能方面发挥重要作用,并有望成为糖尿病、肥胖症、恶病质等代谢相关疾病诊断及治疗的新靶点。该文将结合Ghrelin来分析LEAP-2的作用,阐述其基本生物学功能和在相关疾病发生发展中的作用以及作为治疗靶点的潜力。