重组肝靶向干扰素工程菌菌株的遗传稳定性研究

研究重组肝靶向干扰素工程菌菌株的遗传稳定性,为重组肝靶向干扰素产业化提供依据。在有选择压力(Amp+)条件下,采用平板划线传代法,将重组肝靶向干扰素工程菌菌株连续传代50代,观察菌落和菌体形态,进行生长速度、质粒稳定性、PCR鉴定、限制性内切酶酶切图谱、测序和表达量检测。结果显示:此工程菌在连续传代过程中,保持了大肠杆菌的典型特征,生长速度与原始种子库无明显差异;各代质粒的PCR和酶切图谱正确,传50代后质粒稳定性接近100%,DNA测序未见基因变异。重组肝靶向干扰素表达水平及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无显著差异。说明肝靶向干扰素工程菌株具有良好的遗传稳定性,为重组肝靶向干扰素的应用奠定了基础。

新型肝靶向干扰素融合蛋白的质量标准研究

目的建立新型肝靶向干扰素(interferon-circumsporozoite protein,IFN-CSP)的质量标准。方法采用细胞病变抑制法进行生物学活性测定;RP-HPLC法及非还原SDS-PAGE法进行纯度分析;BCA法、ELISA法、抗生素微生物学检定法、凝胶法分别测定蛋白质含量、宿主菌蛋白质残留量、氨苄青霉素残留量和细菌内毒素含量;紫外光谱法确定吸收峰位置;液质联用技术进行肽指纹图谱分析;Edman降解法检测N-端氨基酸序列。结果 IFN-CSP的生物学活性、纯度、蛋白质含量、宿主菌蛋白质残留量、氨苄青霉素残留量及细菌内毒素的检验结果均在质量标准控制范围内,符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2015年版《中国药典》对重组干扰素α2b质量标准的要求。紫外光谱检测吸收峰约在225 nm处,液质联用分析肽指纹图谱覆盖率达80%,N-端氨基酸序列结果显示其N端前15个氨基酸与天然蛋白质一致。结论 IFN-CSP符合基因工程药物质量标准的要求,为其进一步应用开发提供了依据。

肝靶向干扰素(IFN-CSP)融合基因原核表达条件的优化

本研究目的是优化肝靶向干扰素(IFN-CSP)在大肠杆菌中的诱导表达条件,以提高蛋白表达量。通过考查培养基pH值、诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间和起始菌浓度等五个因素对IFN-CSP融合基因原核表达量的影响,在此基础上,从上述影响因素中各选取4个水平进行正交实验作进一步分析。结果表明,起始菌浓度和诱导温度为影响表达的主要因素,最佳组合诱导条件为OD600为0.8时开始诱导、诱导4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L、培养基pH值为6.0,融合蛋白的表达量高达74.3%。通过表达优化后,IFN-CSP的产量为688.8mg/L,提高了1.2倍。这为进一步制定生产工艺和评价IFN-CSP的生物活性奠定基础。

地高辛探针检测重组肝靶向干扰素宿主DNA残留量的研究

目的:建立检测重组肝靶向干扰素宿主DNA残留量的方法,根据此法检测3批重组肝靶向干扰素每人份剂量宿主DNA残留量。方法:以重组肝靶向干扰素工程菌基因组DNA为模板,并制备探针,用此标记探针对3批重组产品进行DNA残留量检测。结果:3批次重组肝靶向干扰素原液每人份剂量宿主DNA残留量均小于10 ng。结论:地高辛标记探针斑点杂交检测DNA残留量具有特异性强,灵敏度高,重现性好,操作简单,能快速高效检定重组肝靶向干扰素原液并对其制备过程进行质量监控。

重组融合蛋白Trx-IFN-CSP复性工艺研究

旨在建立并优化融合蛋白Trx-IFN-CSP的复性工艺。对重组融合Trx-IFN-CSP进行体外复性研究,考查p H、温度、蛋白浓度、氧化还原体系及辅助复性小分子等复性条件对融合蛋白重折叠的影响。结果显示,适合Trx-IFN-CSP复性的方法为,反复冻融联合超声破菌获得包涵体;用含有1%Triton X-100、2 mol/L尿素、2%DOC洗涤液初步纯化包涵体;再用6 mol/L盐酸胍溶解液变性包涵体;脉冲加样稀释变性液后4℃条件下梯度透析复性,使用L-Arg辅助复性。经肠激酶切去Trx标签后,每升发酵液最终获得110-130 mg肝靶向干扰素,每批蛋白纯度都在95%以上,比活性在1.9-2.4×108 U/mg之间,制备工艺稳定。

重组融合蛋白Trx-IFN-CSP的肠激酶酶切及纯化

[目的]重组融合蛋白Trx-IFN-CSP的肠激酶酶切及纯化研究。[方法]选用国产肠激酶,在不同反应条件下酶切重组融合蛋白,15%的SDS-PAGE检测切割产物,并利用Ni2+亲和层析色谱联合肝素亲和层析色谱对酶切产物进行分离纯化。[结果]0.8 U的肠激酶在温度为10℃下酶切72 h能够完全裂解50μg融合蛋白。酶切产物经亲和层析色谱纯化,可获得电泳纯达99%的目的蛋白。[结论]重组融合蛋白Trx-IFN-CSP经肠激酶酶切及纯化后,可获得纯度达99%的肝靶向干扰素IFN-CSP单体,为进一步研究肝靶向干扰素的生物学活性及产业化开发奠定了基础,也为融合蛋白后处理工艺提供了技术借鉴。