肝靶向穿膜肽与家蝇天蚕素基因的融合及其分子特征分析

本研究利用改进SOE-PCR技术构建肝靶向穿膜肽(HTPP)与家蝇天蚕素(MDC)融合基因并对其分子特征进行了预测和分析。结果表明:成功融合了HTPP与MDC,并构建了HTPP-MDC融合基因的克隆重组质粒HTPP-MDC/pMD20-T。PCR和KpnⅠ/HindⅢ双酶切结果显示获得与预期大小一致的基因片段,测序结果显示获得的基因序列没有发生突变,与预期完全一致。分子特征分析表明,该融合基因编码60个氨基酸,分子量为6516.2Da,理论等电点为9.31,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成。研究结果为HTPP-MDC后续的功能研究奠定了基础,同时也为应用SOE-PCR技术构建融合基因提供了有益借鉴。

新型融合多肽HTPP-MDC体外抑制HBV复制活性及亚细胞定位

目的:研究肝细胞靶向穿膜肽-家蝇天蚕素(HTPP-MDC)融合多肽体外对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用及其在肝细胞中的定位。方法:不同浓度HTPP-MDC分别与HepG2.2.15细胞和Chang liver细胞共培养,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测药物对细胞的毒性作用,应用ELISA和实时荧光定量PCR技术定量研究HTPP-MDC对HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制的影响。应用激光共聚焦技术研究HTPP-MDC在肝细胞中的定位。结果:HTPP-MDC在体外能有效抑制HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg和HBeAg,对HBVDNA的复制亦有显著抑制作用。激光共聚焦显微镜观察显示HTPP-MDC进入细胞内部。结论:HTPP-MDC在体外对HBV复制有较强的抑制作用,并能快速透过细胞膜进入细胞内,有望用于临床治疗慢性乙型肝炎相关疾病。

HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

通过双酶切、连接、转化等方法将肝靶向穿膜肽-家蝇天蚕素(HTPP-MDC)融合基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建重组表达质粒HTPP-MDC/pET32a。重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后,以IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明重组融合蛋白得到了可溶性表达,Western blot杂交证实了表达蛋白的抗原活性。为HTPP-MDC的生物学活性研究及产业化开发奠定了基础。