SMART技术构建人肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库

目的：构建肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库，方法：从肝癌细胞提取总RNA，纯4LmRNA。用逆转录酶链式反应（RT-PCR）反转录合成cDNA第1链，LD-PCR合成cDNA第2链，除去〈500bp小片段，与λTripLEx2噬菌体载体连接并体外包装，转化大肠感菌Ecoli XL1-blue，测定文库的库容和重组率，PCR鉴定插入cDNA片段大小．结果：构建的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库，原始库容为3．4×10^6pfu／mL，重组率为98．2％；文库扩增后库容为9.6×10^8pfu／mL，重组率为97.2％．重组子插入cDNA片段大小0．6-2（平均1.4）kb结论：成功构建高质量的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库，为肝癌特异性抗原的筛选和鉴定奠定了基础．

利用噬菌体表面展示技术构建人肝癌细胞的cDNA表达文库

目的:筛选对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出含有其cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础。方法:hALR刺激不同肝癌细胞株,从中筛选出对hALR刺激有高反应性的细胞株。以PolyATtractSystem1000提取mRNA,用T7Select10-3OrientExpresscDNACloningSystem和RandomPrimer构建它的cDNA噬菌体表面展示文库;以噬菌体滴度分析和PCR评价文库质量。结果:hALR对不同肝癌细胞株均有不同程度的促增殖作用,且呈明显的剂量依赖关系。对QGY促增殖作用最强,以它作为建库细胞。对所建文库进行噬菌体滴度分析,表明原始cDNA文库含有2×107独立的重组子;随机挑取重组子进行PCR鉴定,发现插入长度在0.2～2kb,平均为0.6kb,能够较好地代表来源细胞中mRNA所表达的几乎所有信息。结论:hALR对所检测的肝癌细胞株均有促增殖作用;QGY细胞对hALR刺激有最高的反应性;以它为基础,构建出库容量为2×107的高质量噬菌体表面展示文库。

鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定

目的:构建鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定。方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7EcoR I/HindIII载体臂,包装并构建cDNA表达文库。对文库进行滴度测定和重组子测定。扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布。结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×1010pfu/mL。插入片段平均长度1440bp,主要分布在750～2000bp之间。结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础。

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。

人卵巢癌cDNA噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的构建人卵巢癌cDNA噬菌体表达文库。方法培养人卵巢肉瘤样癌细胞系细胞,提取总RNA,在RNA转录本5′末端开关机制(switching mechanismat5′end of RNAtranscript,SMART)寡核苷酸参与下,反转录合成cDNA第一链,用长距离聚合酶链式反应(long-distance PCR,LD-PCR)合成cDNA第二链并扩增双链DNA,鉴定扩增产物。采用层析离心柱除去小于500bp的片段后,与去磷酸化的SfiⅠ酶消化的λTriplEx2噬菌体载体连接,用GigapackⅢGold包装提取物体外包装噬菌体,感染宿主菌XL1-Blue,滴定原始文库以确定库容量大小,用蓝白斑试验测定重组率。随机挑取12个白色噬斑,采用平板裂解法扩增,用λ噬菌体DNA纯化试剂盒提取、纯化DNA,用SfiⅠ酶切鉴定插入片段大小。扩增原始库后保存备用。结果 PCR产物琼脂糖凝胶电泳在400bp^7kb的弥散背景下,可见到数条对应于优势转录本的特征性条带,符合哺乳动物细胞的特征。构建成含5×106pfu/ml的人卵巢癌cDNA噬菌体表达文库,重组率为99.0%,插入外源cDNA片段大小范围500bp^4kb,平均长度约1.79kb。扩增库滴度2.7×109pfu/ml。结论成功构建人卵巢癌cDNA噬菌体表达文库,可进一步用于筛选卵巢癌相关抗原基因。

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cD-NA。双链cDNA经末端削平、EcoRⅠ接头连接、XhoⅠ酶切、过柱分级分离,除去<400bp片段。收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAPExpress载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库。结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109pfu/L,重组率97%。重组子插入cDNA片段平均大小1kb以上。结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础。

斑节对虾肝胰腺全长cDNA表达文库的构建

采用PolyATtract1000系统提取完整的斑节对虾肝胰腺mRNA,ZAPExpresscDNA合成试剂盒合成具有EcoRⅠ和XhoⅠ末端的双链cDNA.cDNA与经EcoRⅠ和XhoⅠ预消化的λZAPExpress载体连接,再经GigapackⅢGold蛋白体外包装和感染E.coli菌株XL1-BlueMRF′,成功构建了库容量为7 7×105,重组率高达99 1%的cDNA表达文库.将初级文库进行扩增,并在滴定扩增文库时随机挑取9个噬菌斑,在辅助噬菌体ExAssist的作用下通过体内切除形成phagemid,再用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切获得插入cDNA片段,其长度最长达1 6kb.我们还用PCR法从库中扩增出完整的肌动蛋白编码区cDNA(约1 2kb).以上结果说明此表达文库含有斑节对虾肝胰腺全长cDNA片段,因此本文库为对虾基因的克隆、表达及其结构和功能的研究奠定了基础.

一种新的乙型肝炎病毒表面抗原结合蛋白的筛选、表达及其生物学活性的初步研究

为了研究乙肝病毒侵染肝细胞过程中的功能蛋白 ,通过印迹免疫分析技术从人肝cDNA噬菌体表达库中筛选出一株编码乙肝表面抗原结合蛋白 (hepatitisBsurfaceantigenbindingprotein ,HBsAg BP)的cDNA克隆 .基因测序结果表明 ,该cDNA具有独立的开放阅读框架 ,编码 1个由 344个氨基酸残基构成的可溶性蛋白分子 ,属于免疫球蛋白超家族成员 .将该基因克隆到原核表达载体pTriplEx后 ,在E .coliXL1 Blue菌株中获得 4 4kD的重组蛋白 .重组蛋白经Western印迹和ELISA实验证明具有与乙肝表面抗原特异性结合的能力 .进一步经流式细胞仪实验显示 ,在纯化的重组蛋白存在的情况下 ,天然的HBsAg与肝细胞株HepG2的亲和力显著增高 .结果显示 ,该乙肝表面抗原结合蛋白可能是介导乙肝病毒对肝细胞亲和侵染的可溶性辅助受体 .

人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的 构建人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。方法 从人大肠癌组织中提取总RNA ,RT PCR反转录合成cDNA第 1链 ,用长距离PCR技术合成cDNA第 2链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段后与λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 ,构建成cDNA噬菌体表达文库。转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,测定重组率。用EXTagTM酶做PCR和SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果 构建成含 2 .39× 10 6pfu/ml重组子的人大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 %。插入的外源cDNA片段大小为 5 0 0bp～ 4kb ,平均长约 1.4kb。 结论 成功构建高质量人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,适合于免疫筛选cDNA克隆的人大肠癌相关抗原基因。

人食管癌细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 构建人食管癌细胞cDNA噬菌体表达文库。方法 从食管癌细胞中提取总RNA,利用磁珠吸附法分离其中的mRNA,逆转录合成cDNA第一链,再通过碱基互补配对原则合成第二链,对双链cDNA进行末端修饰,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5′端,除去不合要求的cDNA片段,将符合要求的与载体（噬菌体T7Select10-3b）连接,然后进行体外包装建成初步的cDNA文库,并对文库进行鉴定。结果 食管癌细胞cDNA原始表达文库的滴度为2.01×106 pfu/mL,重组率高达100%,插入片段的大小范围在300~1 500bp之间。结论本实验成功构建了人食管癌T7噬菌体展示cDNA表达文库,并经过了初步鉴定,为下一步利用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术（SEREX技术）鉴定食管癌相关抗原奠定基础。

人源性大肠癌抗原基因的SEREX筛选

目的:寻找人源性大肠癌相关抗原基因.方法:构建3个以入Tripl Ex2噬菌体作载体的大肠癌抗原cDNA表达文库,用自体或异体大肠癌患者血清应用SEREX方法进行免疫筛选.用平板法扩增阳性克隆噬菌体,提取纯化DNA,用SfiI酶切和PCR鉴定插入片段的大小.结果:构建成3个大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库,滴度分别为2.39×106nfu/L,2.07×106nfu/L和1.86×106nfu/L,插入片段长度为0.5-4kb,平均分别为1.4kb,1.6kb和1.3kb.筛选发现4个阳性克隆,插入cDNA片段大小分别为2.4 kb,1.8 kb,2.3 kb和2.2 kb.结论:用SEREX方法筛选大肠癌抗原cDNA表达文库,可获得有价值的大肠癌的重组抗原基因克隆,将有利于大肠癌的早期诊断和重组疫苗的研究.

用抗细胞表面分子单链抗体筛选和鉴别其相互作用肽

展示于噬茵体表面的肽库适于用抗体筛选其特异性结合表达肽。scFv-C193是一个抗KGla细胞表面分子的单链抗体,其抗原仍不清楚,为了筛选并鉴定其识别分子,用8cFv-C193筛选了1个展示于T7噬茵体表面的人胎肝cDNA片段库。经4轮生物吸附后分离单个阳性噬斑,并对其表达产物做电泳分析及斑点杂交。结果鉴别出1个scFv-C193结合肽,scFv-C193+克隆噬菌体DNA插入片段的PCR扩增和序列分析结果表明它是1个43bpDNA片段表达产物。BLAST分析EST人类基因数据库,发现它97%相同于CD34+造血干/祖细胞mRNA的1-43bp,提示scFv-C193识别片段存在于人类造血干/祖细胞基因中,单克隆单链抗体scFv-C193可能用于研究这些人类基因的性质。