槲皮苷减轻TNF-α诱导的肠上皮屏障功能障碍

目的探究槲皮苷对TNF-α诱导的结肠腺癌细胞(colorectal adenocarcinoma cell, Caco-2)单层膜肠上皮屏障功能损伤的保护作用及其机制。方法 Caco-2细胞接种于镶嵌0.4μm孔径Transwell小室聚碳酸酯膜上,并培养21d以获得Caco-2细胞单层膜。接着,将Caco-2细胞单层膜随机分空白对照组(未用任何药物处理)、单纯TNF-α组(仅用100ng/mL TNF-α处理72h)、TNF-α+槲皮苷低、中、高剂量组(分别用25、50和100μmol/L槲皮苷预处理30min后,再用100ng/mL TNF-α处理72h)。采用MTT法检测细胞活力,采用ELISA和RT-qPCR分别检测各组中白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白介素6(interleukin 6,IL-6)和环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)分泌水平和mRNA表达水平,采用跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)和FITC标记葡聚糖40 kD(FITC-dextran 40kD,FD-40)通量评估各组Caco-2细胞单层膜的渗透性,采用免疫荧光检测各组中闭合蛋白(occludin)和闭锁小带蛋白1(zonula occludens protein1,ZO-1)的分布,采用Western blot分析各组中occludin、 ZO-1、肌球蛋白轻链激酶(myosin light-chain kinase,MLCK)和磷酸化的肌球蛋白轻链(phosphorylated myoglobin light chain,p-MLC)水平。结果槲皮苷抑制Caco-2细胞单层膜中TNF-α诱导的促炎因子IL-1β、IL-6和COX2分泌水平和mRNA表达水平,减弱TNF-α诱导的TEER下降和FD-40通量增加,改善TNF-α诱导的occludin和ZO-1的分布和水平。此外,槲皮苷显著抑制TNF-α诱导的MLCK和p-MLC表达增加。结论槲皮苷可减轻TNF-α诱导的Caco-2细胞单层膜肠上皮屏障损伤,MLCK/p-MLC信号抑制可能是其保护作用的机制之一。

槲皮素改善TNF-α诱导的肠上皮Caco-2细胞功能障碍

为研究槲皮素改善TNF-α诱导的肠屏障功能障碍的细胞模型作用,实验采用TNF-α200 ng/mL孵育Caco-2单层细胞24 h构建上皮屏障功能障碍的模型,再采用槲皮素(5,15,30μmol/L)干预模型,考察槲皮素对上皮单层细胞通透性及上皮的紧密连接(TJ)蛋白Claudin-1和Occludin蛋白功能及表达的影响。结果表明,与正常对照组比,TNF-α组的上皮通透性增强,屏障功能障碍,且TJ蛋白中的Claudin-1、Occludin的磷酸化成分减少。槲皮素干预模型细胞后浓度依赖地增强上皮屏障功能,上调Claudin-1、Occludin的磷酸化成分及Occludin的整体蛋白成分。提示槲皮素可通过加强紧密连接蛋白的结构和功能改善肠上皮屏障功能。