谷氨酰胺对肠产毒素性大肠杆菌感染小鼠肠道损伤的保护作用

【目的】探究谷氨酰胺(glutamine,Gln)对肠产毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染小鼠肠道损伤的保护作用,为Gln缓解大肠杆菌性肠损伤提供理论依据。【方法】选取健康的SPF级昆明小鼠24只,随机分为3组:对照组(Con)、模型组(ETEC)、Gln干预组(ETEC+Gln)。Con和ETEC组小鼠采用灌胃方式每天给予0.2 mL生理盐水,ETEC+Gln组小鼠给予0.2 mL 1%Gln,于试验第7天,ETEC和ETEC+Gln组小鼠采用灌胃方式给予0.2 mL 8.6×109 CFU/mL ETEC K88,试验期10 d。每天对小鼠进行称重;采用HE和PAS染色观察空肠病理变化;采用ELISA法检测血清炎症因子的浓度;采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测空肠炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)、紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-1、ZO-1)、肠上皮细胞增殖(TGF-β1、PCNA、EGF)和凋亡(Bax、Bcl-2)相关指标的mRNA和蛋白表达水平;采用免疫组化检测空肠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的蛋白表达情况。【结果】与Con组相比,ETEC组小鼠体重显著下降(P<0.05),而Gln处理缓解了体重下降的趋势;ETEC组小鼠脾脏指数显著高于Con和ETEC+Gln组(P<0.05);与ETEC组相比,Gln处理显著提高了小鼠空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度比值、杯状细胞数量和黏液层厚度(P<0.05)。与Con和ETEC+Gln组相比,ETEC组小鼠血清IL-1β和TNF-α含量、D-乳酸(D-lac)浓度、二胺氧化酶(DAO)活性均显著升高(P<0.05);与ETEC组相比,Gln干预显著降低了小鼠空肠IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、TLR4、NF-κB p65和Bax的mRNA表达水平(P<0.05),显著增加了小鼠空肠Occludin、Claudin-1、ZO-1、Bcl-2、PCNA和TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。【结论】Gln干预可通过抑制肠道炎症反应、促进肠道上皮细胞增殖和提高肠上皮细胞紧密连接等缓解ETEC K88感染引起的小鼠肠道损伤。

产肠毒素性大肠杆菌K88的致病特性及其益生菌的筛选

在获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的菌株K88-GFP并证明其与K88具有遗传同质性的基础上,以K88-GFP为致病菌,腹腔注射侵染小鼠,在不同时间进行眼球采血,测定血液生理生化指标,并采取不同器官或组织,培养后利用紫外光激发K88-GFP的绿色荧光,观察计数这种产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)在小鼠体内的分布。同时通过体外抑制和活体饲喂试验,进行了益生菌的筛选。结果证实,ETEC致病菌具有较强的侵袭性,它可以侵袭小鼠肝、肾、心、肺及脑、肌肉等器官和组织,尤其可对肝、肾造成严重的损伤;筛选得到益生菌株PB JK-2,在体内外均对K88具有较好的抑制作用。

产肠毒素性大肠杆菌致病因子F_(41)、K_(99)菌毛基因的克隆与表达

目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选到可以表达F41和K99菌毛亚单位的菌株。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot试验分析原核表达的F41和K99重组蛋白的抗原性。结果表达的F41和K99菌毛亚单位蛋白可以与抗F41和K99菌毛蛋白的单因子血清反应。结论原核表达的F41和K99重组蛋白具有良好的抗原性。

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用 PCR从产肠毒素性大肠杆菌 ( ETEC)中扩增出不含信号肽序列的 K99菌毛蛋白基因片段 ,克隆测序后 ,将该片段连接到 E.coli表达载体 p ET2 8a( + )中 ,转化 E.coli表达菌株 BL2 1 ( DE3) ,筛选得到可诱导表达 K99抗原的工程菌株。经 IPTG诱导 ,分离纯化 K99重组蛋白 ,以其免疫新西兰大白兔 ,获得重组蛋白的兔抗血清 ;免疫印迹分析表明 ,此重组蛋白制备的抗血清能与标准的

检测K88^+肠毒素性大肠杆菌PCR方法的建立

以K8 8菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了一对可扩增长 2 0 1bp的目的片段的引物 ,成功地建立了检测肠毒素性大肠杆菌(ETEC)K88菌毛基因的PCR方法。进行了PCR方法的特异性试验和敏感性试验。对K99+ ,F41 + ,987p+ 参考菌株和鼠伤寒沙门氏杆菌 ,链球菌 ,金黄色葡萄球菌和猪肺疫巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该检测方法的敏感度可达 1 0个细菌。用此方法对 1 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,结果有 2株阳性 ;与血清学检测的结果一致。结果表明此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床K88+

腐殖酸钠对肠产毒素性大肠杆菌K88感染小鼠肠道损伤的保护作用

本研究旨在探究腐殖酸钠(HNa)对肠产毒素性大肠杆菌K88(ETEC K88)感染小鼠肠道损伤的保护作用。选取健康的无特定病原体(SPF)级雌性昆明小鼠30只,随机分为3组,对照组、模型组(ETEC组)、HNa干预组(ETEC+HNa组),每组10只。对照组和ETEC组小鼠每天灌胃0.2 mL生理盐水,ETEC+HNa组小鼠每天灌胃0.2 mL 5%HNa;试验第8天,ETEC和ETEC+HNa组小鼠灌胃0.2 mL 5×10^(10)CFU/mL ETEC K88。试验期10 d。采用苏木精-伊红(HE)染色法观察空肠病理变化,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清炎症因子含量,采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测肠道屏障相关蛋白的mRNA表达,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测空肠紧密连接、黏附连接、肠道组织炎性小体和细胞凋亡相关蛋白的表达。结果表明:1)与对照组和ETEC+HNa组,ETEC组小鼠体重及空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度显著降低(P<0.05)。2)与对照组和ETEC+HNa组相比,ETEC组小鼠血液白细胞、单核细胞、粒细胞数量及血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(D-Lac)含量显著升高(P<0.05),血清白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-10(IL-10)含量显著降低(P<0.05)。3)与对照组和ETEC+HNa组相比,ETEC组空肠闭合蛋白(Occludin)、封闭蛋白-1(Claudin-1)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和黏蛋白-2(MUC-2)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),空肠Claudin-1、ZO-1、E-cadherin和MUC-2的蛋白表达量也显著降低(P<0.05)。4)与对照组和ETEC+HNa组相比,ETEC组空肠核因子-κB(NF-κB)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达量显著升高(P<0.05),空肠B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的蛋白表达量显著降低(P<0.05)。5)与对照组相比,ETEC组粪便大肠杆菌数量显著增加(P<0.05),粪便乳酸菌数量则显著降低(P<0.05)。与ETEC组相比,ETEC+HNa组粪便大肠杆菌显著降低(P<0.05)。由此可见,HNa可以通过抑制肠道组织炎性小体激活、肠道上皮细胞凋亡以及上调肠道屏障相关蛋白的表达缓解ETEC K88感染引起的肠道损伤。

大肠杆菌K88噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

分离鉴定裂解性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)K88噬菌体,并研究其生物学特性及裂菌效力。用双层平板法从猪场污水中分离噬菌体,通过透射电镜和酶切基因组对获得的噬菌体进行鉴定;同时测定了噬菌体最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱稳定性、热稳定性等噬菌体的生物学特性及其体外裂菌效力。结果表明分离获得了一株产肠毒素性大肠杆菌K88强裂解性噬菌体,命名为PK88-4;其噬菌斑清晰透亮,周围无晕环;电镜显示:其头部呈正多面体对称,有可伸缩性尾部;核酸类型为双链DNA(基因组大小约60 kb);该噬菌体能耐受60℃左右高温、在pH值为5～10内效价稳定;最佳感染复数为0.01;潜伏期为10 min,暴发期为40 min,裂解量为40;在5 h内对培养液中的大肠杆菌杀灭率将近100%。PK88-4是一株强裂解性肌尾科大肠杆菌K88噬菌体,具有裂解周期短、杀菌能力强等特点,为畜牧业防治产肠毒素性大肠杆菌K88感染提供了新的思路。

仔猪产肠毒素性大肠杆菌和产气荚膜梭菌引发腹泻的症状与防治

1产肠毒素性大肠杆菌 产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是新生仔猪腹泻最为常见的病原。ETEC菌株引起疾病的能力主要取决于菌株在小肠内的吸附、增殖和定植的能力以及产生肠毒素的能力。能引起新生仔猪腹泻的ETEC菌株可产生热敏感的肠毒素（LT）或两种热稳定的毒素。定植因子决定了大肠杆菌在动物肠道定植的能力。如果能发生细菌定植，则产生的毒素会引起腹泻，其可与黏膜表面细胞的特异性受体结合而定植于黏膜。

共表达ETECK99、K88菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统。重组干酪乳杆菌在MRS培养基中表达后,经SDS-PAGE检测,约有90 KDa的融合蛋白得到表达,蛋白大小与理论值相符合。Western-blot分析表明表达的蛋白可被鼠源K99,K88抗血清所识别。间接免疫荧光技术和流式细胞术的结果表明,融合蛋白成功地利用多聚谷氨酸跨膜蛋白pgsA基因展示在干酪乳杆菌菌体表面。

纯化ETEC K88菌毛特异性卵黄抗体的加工贮藏及体外抗粘附性研究

分离、纯化产肠毒素大肠杆菌(ETEC) K88ac菌毛蛋白,将其免疫产蛋鸡,经喷雾干燥制备抗ETEC菌毛抗原特异性卵黄抗体粉。间接ELISA法检测卵黄抗体效价,试验结果表明,喷雾干燥(140℃进气,65℃出气)对卵黄抗体活性无影响,加工前后抗体滴度均为1∶1280;卵黄抗体粉在90℃干热条件下处理5min后抗体效价下降50%,而90℃湿热条件下处理5min抗体效价无明显变化,但处理15min后下降75%;经过1h的干热或湿热处理,抗体均基本失活;4℃和常温下放置半年对卵黄抗体粉活性无影响;体外抑制粘附试验表明,抗K88卵黄抗体能抑制K88对肠上皮细胞的粘附。

浙江省猪源产肠毒素大肠杆菌分子流行病学调查

本研究旨在调查浙江省猪源产肠毒素性大肠杆菌的流行情况和毒力基因特征。采用标准细菌学方法对大肠杆菌进行分离,并用聚合酶链反应(PCR)方法检测大肠杆菌的毒力基因。2014-2021年共分离到137个携带ETEC黏附素或肠毒素基因的大肠杆菌菌株,其中禁抗后平均每年分离到的菌株数量是禁抗前的2倍。肠毒素基因检测结果表明,STb(129/137,94.2%)最常见,其次是STa(64/137,46.7%)和LT(62/137,45.3%);黏附素基因以F18(56/137,40.9%)最占优势,其次为K88(28/137,20.4%),未检测到K99和987P及F41等黏附素。上述137个临床分离株中共检测到16种不同的毒力因子模式,平均每8.6个菌株产生一种不同的毒力因子模式;其中39.4%的菌株仅携带肠毒素基因,检测不到经典的黏附素基因,而1.5%的菌株则与之相反。共有81株菌同时检测到肠毒素和黏附素基因,占检出总数的59.1%。在所有被检测的生长阶段,肠毒素STb均为检出率最高的肠毒素,且随着日龄增加检出率逐渐降低。黏附素F18随着仔猪日龄的增加检出率不断提高;K88黏附素在各个生长阶段均能检出,尤其在产房仔猪中检出率最高。口腔灌服不同毒力因子模式ETEC菌株对小鼠的致死率介于0~40%,攻毒7 d后不同组的小鼠肠内容物中攻毒菌株的带菌率介于0~100%。综上所述,饲料禁抗后浙江省腹泻猪群中ETEC分离率明显上升,所携带的肠毒素以STb为主,黏附素以F18为主。菌株的毒力因子模式复杂,对小鼠的致病力及在小鼠体内的持续存活能力有明显差异,说明小鼠作为猪源ETEC的传播媒介作用在不同菌株间存在较大差异。

特异性ETEC K99-SIgA免疫复合物增强小鼠黏膜免疫反应的研究

为探究产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)特异性K99-SIgA免疫复合物对激发小鼠黏膜免疫反应的影响,本实验构建pET-32a-K99/BL21(DE3)原核表达载体,经IPTG诱导表达后以亲和层析方法纯化制备了重组K99蛋白(rK99);采用rK99蛋白和ETEC标准菌株K99经腹腔注射免疫BALB/c小鼠制备鼠源K99多克隆抗体;采用PBS溶解的ETEC K99菌液口服感染BALB/c小鼠,获得含有特异性SIgA抗体的粪便上清,以His pull-down制备得到特异性K99-SIgA复合物;利用特异性K99-SIgA复合物刺激ETEC K99口服感染小鼠后分离的脾淋巴细胞,分别采用ELISPOT检测细胞因子、CCK-8法检测小鼠脾T淋巴细胞增殖以及小鼠T淋巴细胞CTLL-2活力。结果显示:rK99在E. coli BL21(DE3)中高效表达,纯化蛋白浓度约4.5 mg/mL;腹腔免疫后的小鼠血清检出较高效价的K99多克隆抗体,腹腔免疫后的小鼠血清检出较高的K99多抗效价;以ETEC K99菌液口服感染小鼠获得大量的特异性SIgA抗体,抗体水平在感染后42 d达到高峰;制备获得特异性K99-SIgA复合物,浓度约为2 mg/mL,K99多抗能够有效地与特异性K99-SIgA复合物反应;特异性K99-SIgA复合物刺激小鼠脾淋巴细胞相比K99单独抗原能更有效地上调TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-5细胞因子分泌水平,促进小鼠脾T淋巴细胞及小鼠效应T细胞CTLL-2的增殖活化,表明特异性K99-SIgA免疫复合物能够有效地增强小鼠的黏膜免疫应答。本研究为免疫复合物口服疫苗的研制提供了参考依据。

大肠杆菌ETEC 987P菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原菌之一，给我国乃至全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。黏附素性菌毛的黏附作用是该菌致病的先决条件[1]。目前，该病的防治主要以药物和疫苗为主，但由于药物的治疗价格昂贵，并且病原菌容易产生耐药性，因此免疫预防成为治疗该病的最佳选择[2]。目前，国内外主要采用灭活苗预防和控制该病，但灭活苗的生产费用比较高，需要佐剂辅助，而且免疫原性较差。此外，灭活苗仅能诱发体液免疫应答，不能产生细胞免疫应答和局部免疫应答；因此，这就迫使我们研制一种安全、有效的新型疫苗来预防该病。