肠出血性大肠杆菌0157:H7感染动物模型的建立

目的 建立肠出血性大肠杆菌O15 7:H7感染小鼠动物模型。方法 不同大小(5、7和9周龄)的Balb/c小鼠分别随机分成3组,先以链霉素处理3d ,再分别以不同剂量(1×10 10 CFU和1×10 9CFU)经口感染具链霉素抗性的0 15 7:H7 SMR2菌株,进行临床观察和微生物学、病理学检查。结果 5和7周龄实验组小鼠在感染后2～5d有33%～83%死亡,肾、肝、肺和肠道出现不同程度的病理变化,所有实验组未死小鼠粪便排菌时间在13～2 2d以上。结论 小鼠感染O15 7后可表现出人类感染O15 7所出现的主要临床症状和病理变化,对研究EHEC的致病机制和疫苗研究有重要意义。

应用酶联免疫吸附试验检测肠出血性大肠杆菌0157:H7方法研究

目的制备和纯化0157:H7抗原,免疫家兔和豚鼠,获得高效价的抗0157:H7免疫血清并进行纯化及酶标记.建立对0157:H7感染患者快速诊断方法,做到早期发现及时治疗,有效控制疫情的蔓延.方法ELISA双抗体夹心法检测0157:H7抗原.步骤:包被特异性抗体,加处理后的粪便等标本,然后加入抗0157:H7酶结合物,最后加入底物显色.结果本课题所研制的抗0157:H7酶结合物只对0157:H7呈阳性反应,而与其他相关细菌无交叉反应.结论应用酶联免疫吸咐试验(即双抗体夹心法)对肠出血性大肠杆菌0157:H7抗原的检测较常规法实验程序简捷、快速、敏感.临床和现场验证结果表明,其方法具有灵敏度高,特异性强操作简单等特点,为肠出血性大肠杆菌0157:H7的鉴定及快速诊断提供了一种新的检测手段.

浙江省首例肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株的分离和鉴定

在１９９７年对杭州地区肠道门诊腹泻患者肠出血性大肠杆菌（ＥＨＥＣ）感染调查中，应用山梨醇麦康凯培养基于一慢性腹泻患者粪便中分离到浙江省首株ＥＨＥＣＯ１５７∶Ｈ７菌株，并对此进行初步鉴定。该菌株为革兰氏阴性杆菌，具大肠杆菌生化特性，但与大多数国外已报道的菌株不同，发酵山梨醇，棉子糖、卫茅醇、赖氨酸、鸟氨酸等均阴性；Ｏ１５７及Ｈ７抗血清玻片凝集试验和试管定量凝集试验结果均为阳性；未检出ＳＬＴ－Ⅰ、ＳＬＴ－Ⅱ和溶血素等毒素基因；药敏试验结果显示。

肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用。方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性。结果获得了大小约2805bp的eae片段;构建了重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面。结论高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础。

郑州市2005年肠出血性大肠杆菌O157:H7感染状况调查

目的:了解郑州市肠出血性大肠杆菌O157∶H7在腹泻病人中的检出情况和宿主动物带菌及毒力基因情况。方法:对采集的宿主动物和腹泻病人粪便及食品应用免疫磁珠富集分离法进行大肠杆菌O157∶H7分离和鉴定。结果:郑州市内共发现3例肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染病例,首次从腹泻病人中检出产毒O157∶H7菌株,采集5种以上动物粪便标本共计475份,从牛粪(247份)中分离到16株O157∶H7,检出率为6.48%,从羊粪(33份)中分离到3株O157∶H7,检出率为9.10%,并检出3株产毒O157∶H7菌株。采集5类市售食品共146份,未分离到O157∶H7。结论:郑州市存在发生肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染暴发或流行的潜在危险。

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

本试验针对肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7高度保守的rfbE基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测EHEC O157∶H7实时荧光定量PCR方法。结果显示,该法灵敏度约为7.3CFU/mL,对310份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出阳性样本20份,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。表明建立的实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。

冷冻原肠中肠出血性大肠杆菌O157:H7的研究

目的检测分析进出境冷冻原肠携带肠出血性大肠杆菌O157∶H7的情况。方法对2010-2011年进境或国产的35份冷冻原肠样品(包括19份冷冻羊原肠和16份冷冻猪原肠)进行检测,根据细菌的培养特性、生化鉴定和血清学鉴定,同时设立标准菌株作为对照。结果 2份原肠样品检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7,检出率为5.71%。结论进境和国产原肠均有可能携带肠出血性大肠杆菌O157∶H7,应该加强监测。

郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染监测

[目的]2005年监测郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染状况及病原分布特点,为各级卫生行政部门制订新发传染病防治措施,提供基础疫情资料。[方法]监测标本用免疫磁珠集菌方法(IMS)做病原学分离培养、毒力基因检测用多重PCR方法、药敏试验用(K-B)常规方法。[结果]腹泻病人标本185份,大肠杆菌O157:H7检出阳性4份。外环境标本588份,检出大肠杆菌O157:H7阳性20份。用多重PCR方法做毒力基因检测,有6份家畜家禽阳性标本中检出O157:H7毒力基因(Stx2、eaeA、HIyA)为阳性。药敏试验24株肠出血性大肠杆菌O157:H7对8种抗菌药物敏感率为95%以上,对新生霉素100%耐药,其余7种对抗菌药物敏感程度各有差异。[结论]郑州市有散在的大肠杆菌O157:H7感染的病人及动物疫点。奶牛和波尔山羊是大肠杆菌O157:H7动物宿主。

PCR-免疫胶体金试纸条方法检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的建立PCR-免疫胶体金试纸条法快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的分析方法。方法通过设计特异性引物建立肠出血性大肠杆菌O157:H7 PCR检测方法并使用免疫胶体金技术以及双抗体夹心法建立PCR产物快速检测试纸条并设计核酸检测展开液;将1株大肠杆菌O157:H7标准菌株和7株其他常见食源性致病菌作为试验菌株,用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度,并比较PCR-免疫胶体金试纸条法和PCR-琼脂糖凝胶电泳法的检测敏感度。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度,灵敏度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。结论本文建立的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好,灵敏度高,价格低廉,适用于食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。

食品中肠出血性大肠埃希菌O_(157):H_7的PCR检测

目的建立快速准确检测食品中肠出血性大肠埃希菌O157:H7的方法。方法采用多重聚合酶链式反应技术(MPCR)特异性扩增肠出血性大肠埃希菌O157:H7的STX、rfbEf、liC基因。结果分别在228,378,709 bp处扩增出3个目的基因片段,且只有肠出血性大肠埃希菌O157:H7获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为食品中肠出血性大肠埃希菌O157:H7的快速检测提供了新的手段。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7黏附HeLa细胞模型的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础。方法以细菌黏附HeLa细胞数量为指标,分别评价细菌数量、细菌与细胞孵育时间对细菌黏附数量的影响,得到最佳条件,最后肌动蛋白荧光染色(FAS)试验鉴定模型。结果加入细菌为1×105CFU,细菌与细胞孵育4h时,黏附细胞的数量最佳,FAS检测发现该条件下细菌能够引起细胞特异性黏附、擦拭(attaching&effacing,A/E)损伤,模型建立成功。结论成功建立O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制提供了条件。

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157:H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157:H7核酸的荧光定量PCR检测方法。实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108cfu/mL。稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06%和2.45%。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。

江苏省肠出血性大肠杆菌O157:H7监测资料分析

目的 :了解江苏省肠出血性大肠杆菌 O15 7:H7在宿主动物与人群中的分布及其毒力基因携带状况 ,调查不同人群中致泻性大肠杆菌的感染率。方法 :用免疫磁珠分离法 (IMS)对江苏省6个监测点的宿主动物和人粪便标本进行 O15 7:H7的分离培养 ,并用多重引物 PCR方法 (MPCR)检测分离菌株的志贺氏样毒素 (SL T1和 SL T2 )、粘附抹平因子 (eae A)及溶血素 (hly) 4种毒力基因。结果 :监测共采集腹泻病人及健康人群粪便标本 130 8份 ,宿主动物粪便标本 130 7份。其中 ,流行前期腹泻病人粪便标本 70 7份中检出肠道致病菌阳性标本 110份 ,阳性率 15 .5 6 %。菌株有 6种肠道致病菌 ,包含 1株 O15 7:H7。流行后期腹泻病人粪便标本 30 2份和健康人群粪便标本 2 99份 ,均未检出肠道致病菌。宿主动物粪便标本 130 7份 ,检出 O15 7:H710株 ,阳性率 0 .76 %。流行后期阳性率2 .2 7% ,非常显著地高于流行前期 (χ2 =16 .94 ,P<0 .0 1)。不同宿主动物中检出存在差异 ,其中牛检出率最高为 1.77%。 11株 O15 7:H7菌株毒力基因测定 ,携带 SL T2 +eae A+hly10株 ,携带 eae A+hly1株。枯水期与丰水期水源水标本 6 9份 ,未检出 O15 7:H7。结论 :江苏省腹泻病人和宿主动物中均能检出肠出血性大肠杆菌 O15 7:H7,且菌株均携带毒力基因。?

用RAPD技术分析出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 应用RAPD技术分析肠出血性大肠杆菌O1 57∶H7DNA多态性并对其分型。方法 用两条1 0bp的随机引物对 3株肠出血性大肠杆菌O1 57∶H7和 3株其它病原性大肠艾希氏菌进行扩增 ,扩增产物经凝胶电泳后得到指纹图。结果 共得到 1 2个不同的DNA指纹图谱 ,经统计软件SPSS系统聚类分析得到两个不同的分类树状图。结论 RAPD技术方法简便、快速、分辨力高 ,在肠出血性大肠杆菌O1