大熊猫源肠外致病性大肠杆菌的分子分型、耐药表型与耐药基因分析

【目的】明确四川大熊猫源肠外致病性大肠杆菌(Ex PEC)的耐药性与耐药基因流行情况,为大熊猫源Ex PEC感染的临床用药提供参考。【方法】从四川省绵阳市和雅安市野外死亡大熊猫的肠外器官采集病料,进行病原菌的分离,通过16S rRNA基因序列分析与Ex PEC多重PCR鉴定,继而对分离的Ex PEC进行系统进化群分群、MLST分型和PFGE分型,并采用K-B法与Wafergen Smartchip超高通量qPCR进行耐药表型测定和耐药基因分析。【结果】分离出9株Ex PEC,系统进化群分别为B2群和A群;MLST和PFGE分型均为3种分子型,其中MLST为ST555、U10和ST127型,PFGE为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型;9株Ex PEC对多黏菌素B、亚胺培南、左氧氟沙星与萘啶酸敏感率达100%;对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类等9类抗生素耐药基因(ARGs)的检测发现,β-内酰胺类和多重耐药类ARGs检出率较高。【结论】分离鉴定的9株大熊猫源Ex PEC系统进化群主要为B2群,MLST和PFGE分型主要为ST127/PFGE基因Ⅰ型,具有明显的多重耐药性,且β-内酰胺类和多重耐药类ARGs检出率较高,主要通过抗生素失活(antibiotic deactivate)和抗生素外排泵(efflux pump)两种耐药机制介导耐药性。

犊牛源肠外致病性大肠杆菌分离鉴定、致病性及耐药性分析

【目的】确定新疆喀什地区某规模化牛场致犊牛死亡的细菌性病原体及其生物学特性,为该地区规模化牛场细菌病的防治和合理用药提供参考。【方法】对死亡犊牛进行病理解剖及病原分离,挑选肝脏(KS-1)与肛拭子(KS-2)来源的单菌落纯化培养,通过形态观察、生化试验、16S rRNA基因扩增及系统进化分群鉴定分离株,并通过毒力基因检测、致病性试验及药敏试验对分离株的致病性和耐药性进行研究。【结果】死亡犊牛肺脏、肝脏、心血、关节液和肠系膜淋巴结以及健康犊牛肛拭子样品接种后菌落生长形态一致,结合选择性培养基上菌落生长形态、革兰染色镜检形态特点、生化特性及大肠杆菌16S rRNA的验证,鉴定分离菌株为大肠杆菌。系统进化分群试验中,KS-1为A群,KS-2为B1群。毒力基因检测结果显示,KS-1携带crl、papC、hlyE、eaeA、ompA、ompC、iucD和iutA共8种毒力相关基因,KS-2携带crl、hlyE和ompF共3种毒力相关基因。致病性试验结果显示,腹腔注射1×108 CFU分离株感染小鼠,KS-1组小鼠在16 h内全部死亡,KS-2组小鼠无死亡现象出现。药敏试验结果显示,KS-1对哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛等17种药物敏感,对氨苄青霉素/舒巴坦和哌拉西林中度敏感,对氨苄西林和复方新诺明耐药;KS-2对哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星和呋喃妥英敏感,对妥布霉素中度敏感,对其余14种药物耐药。【结论】本研究分离出2株犊牛源大肠杆菌,其中KS-1毒力较强,且携带丰富的毒力基因,对大部分常用抗生素敏感,对氨苄西林和复方新诺明具有耐药性;KS-2携带毒力基因较少,呈现多重耐药。

自转运丝氨酸蛋白酶在猪源肠外致病性大肠杆菌致病过程中的作用

为了探究猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的致病机制,以自转运丝氨酸蛋白酶(SPAT)为关注点,构建了单基因和双基因缺失株,通过亚细胞定位、红细胞凝集及黏附、黏蛋白裂解和小鼠感染等试验,探究SPAT1和SPAT2在猪源ExPEC致病过程中的作用。结果显示:猪源ExPEC强毒菌株PU-1分别在染色体及毒性质粒上编码SPAT1和SPAT2;通过间接免疫荧光和Western blot检测发现2个蛋白表达于细菌表面且可分泌到培养上清液;血凝试验和红细胞黏附ELISA检测发现,SPAT1和SPAT2可引起红细胞凝集,并黏附于红细胞表面;黏蛋白裂解试验和流式细胞术分析发现,SPAT1和SPAT2可裂解宿主呼吸道黏蛋白以及中性粒细胞表面糖蛋白CD44和CD93;小鼠感染试验发现,SPAT1和SPAT2双基因缺失导致菌株毒力显著降低,且小鼠血液载菌量大幅下降,中性粒细胞数量明显上升。本研究鉴定的2个SPAT可作为防控ExPEC引起猪肠道外感染的潜在药物靶标,为防控猪群ExPEC感染方案的制定提供参考。

黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内保护作用

为探究黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)感染小鼠后的保护作用,采用小鼠存活率试验和组织载菌量试验评估黄芩苷对小鼠的保护作用,比较感染组和黄芩苷治疗组小鼠临床表现、存活率、组织载菌量及病理变化。结果表明,猪源肠外致病性大肠杆菌感染后小鼠状态萎靡不振、食欲下降,黄芩苷治疗组小鼠状态较感染组状态好;黄芩苷治疗组小鼠存活率相对于感染组有一定提升;黄芩苷治疗组小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏中组织载菌量及病理变化相对于感染组均极显著降低(P<0.01)。

猪源肠外致病性大肠杆菌的分离与鉴定

目的检测猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的血清型与毒力基因。方法对2013-2014年间秦皇岛地区30份组织病料采用细菌形态观察、培养特性试验、生化试验鉴定出8株肠外致病性大肠杆菌。采用玻片凝集法测定这些大肠杆菌病的血清型,并用PCR扩增法检测9种毒力基因。结果定型菌株5株,分别属于O53、O93和O157 3个血清型,9种毒力基因PCR检测结果表明ler、iutA、irp2、fyuA、astA 5种基因检出率分别为100%、75.0%、50.0%、50.0%、25.0%。结论所检测的猪源肠外致病性大肠杆菌以O53、O93和O157为主要流行血清型,同时携带fyuA、ler和iutA基因的菌株致病性较强。

河南地区猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性试验

为了解猪源肠外致病性大肠杆菌在河南地区的流行及耐药性,本试验于2016—2018年从河南省61家猪场送检的发病猪中,采集肺脏等病料,进行大肠杆菌的分离与鉴定,并用微量稀释法测定分离菌株的耐药性,采取PCR法检测分离菌株中氟苯尼考耐药基因(floR)、Ⅰ类整合酶基因的携带情况,通过Ⅰ类整合子基因盒可变区序列的BLAST比对,分析其耐药基因携带情况。结果显示,经细菌分离共获得17株肠外致病性大肠杆菌,检出率为27.86%(17/61);分离菌株对氨苄西林、磺胺甲噁唑、四环素、氟苯尼考和氯霉素等药物耐药率为100%,对多黏菌素耐药率为41.18%,分离菌株均呈多重耐药;在分离菌株中,floR、Ⅰ类整合子携带率均为100%,Ⅰ类整合子基因盒主要携带dfrA17-aadA5、aadA22-aadA23-aadA25、dfrA12、dfrA12-aadA2和floR等类型耐药基因谱。本试验结果表明河南地区猪源肠外致病性大肠杆菌具有一定的流行性,且耐药问题十分严重,极易导致临床上治疗失败,应引起重视。

肠外致病性大肠杆菌的研究进展

肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)是一类特定定植于宿主肠道外其它组织,并严重致病的一类新的大肠杆菌菌群。本文对肠外致病性大肠杆菌的流行、危害及防治进行了综述。

四川地区猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性检测

本试验对四川地区52个猪场送检的210个病死猪样本进行了肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定和耐药性检测。通过培养特性、染色特点、形态观察、PCR鉴定及致病性试验，共分离到40株肠外致病性大肠杆菌．其中以肺脏和淋巴结的分离率最高。40株肠外致病性大肠杆菌中，有34株同时耐6种以上的受试药物，其中对四环素、氨苄西林和卡那霉素的耐药率最高（大于80％），对喹诺酮类药物的耐药率为50％～52．5％。对氨苄西林，舒巴坦、阿米卡星、头孢克肟保持较高的敏感性，耐药率小于20％。

肠外致病性大肠杆菌研究

肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)是近年来出现的引起人和动物免疫系统受损的主要临床病原体,由不同血清型且不发生交叉反应的菌株引起,部分菌株具有高度耐药性是导致感染严重程度的主要因素之一。对目前ExPEC的主要感染类型、毒力因子以及抵御感染的潜在手段进行了概述。

摄铁系统及自分泌毒素对猪源肠外致病性大肠杆菌毒力发挥的影响

为了探究猪源肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)的致病机制,本研究通过小鼠感染模型筛选强毒菌株,以PU-1为强毒代表株进行全基因组测序(染色体登录号CP042246,质粒登录号CP042245)及分析,以铁摄取系统及自分泌毒素为关注点探究上述毒力因子在PU-1株中的编码情况,并构建单基因或多基因缺失株,探究摄铁系统及自分泌毒素在猪源ExPEC致病过程中的作用。结果显示:摄铁系统及自分泌毒素基因在血液定殖的细菌中不同程度上调,最高上调可达11倍;铁摄取系统相关基因缺失株fyuA-ybtQFX、ΔiroBCDEN、Δfur及ΔsitABCD_(Both)对感染小鼠的致病力与野生株相比显著减弱,在感染动物血液载菌量不同程度下降,最高下降至野生株的1/15左右;自分泌毒素相关基因缺失株Δvat及ΔcdtABC对感染小鼠的致病力与野株相比显著减弱,在感染动物血液载菌量下降至野生株的1/2左右。上述结果表明,摄铁系统FyuA-YbtQFX、IroBCDEN、SitABCD及SitABCD-Plasmid的有效组装,及空泡形成毒素Vat和Cdt-I型细胞致死膨胀毒素的成功转运对猪源ExPEC分离株PU-1的毒力有影响。本研究结果有助于更好地理解猪源ExPEC的致病机制,上述被鉴定的毒力因子可作为防控猪源ExPEC引起猪肠道外感染的潜在药物靶标,为防控猪群ExPEC感染方案的制定提供参考。

猪、鸡与貂源肠外致病性大肠杆菌群型、耐药性与致病性分析

为检测不同动物源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的耐药及致病性差异,本研究从132份鸡、猪和水貂等动物肠道外组织中分离鉴定大肠杆菌,并对分离菌株进行了16S rRNA基因测序、毒力基因检测、药敏试验、O抗原鉴定、系统进化群分析及动物致病性试验。实验结果显示:分离出53株ExPEC,且至少携带特异性毒力基因pap、sfa/foc、afa/dra、iutA、kpsMTII中的两种基因,并携带fimH、ibeA、hlyA、malX、iss、iroN等其它相关毒力基因。53株ExPEC分离株对氯霉素、卡那霉素、头孢噻吩、四环素、多粘菌素B、氨苄青霉素等呈现不同程度的多重耐药性;O抗原主要分布于O1、O2、O8、O11、O38、O78、O120血清型;系统进化群分析结果显示:28株属于A群,19株属于B1群,1株为B2群,5株属于D群。选取20株ExPEC分离菌株按照6×10~6cfu/只对小鼠进行腹腔注射,验证其致病性;并测定ExPEC6、ExPEC42、ExPEC52、ExPEC53菌株对BALB/c小鼠的LD_(50),其结果分别为3.49×10~6cfu/mL、9.49×10~5cfu/mL、9.48×10~6cfu/mL、2.38×10~7cfu/mL。本研究为动物源性ExPEC的预防诊断提供依据,并为下一步研究其致病机理等奠定基础。

猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性

【目的】从临床病死仔猪体内分离肠外致病性大肠杆菌,研究猪群中流行菌株的毒力基因分布、耐药性、致病性情况.【方法】病死仔猪肠外组织分离大肠杆菌,然后进行16S rDNA PCR测序鉴定、种系发育分群、毒力基因检测、抗菌药物的药敏试验、小鼠致病性试验、全基因组测序验证.【结果】共筛选到30株猪源肠外致病性大肠杆菌,其中A群4株、B1群15株、B2群5株、D群6株;毒力基因检测结果发现vaT、iutA、kpsMII、hlyD基因检出率分别为70.0%、33.33%、23.33%、20.0%;药敏试验结果显示:菌株都对多粘菌素B较敏感,对氨苄西林、林可霉素、杆菌肽以及利福平的耐药率为100%;获取了Ex-P27菌株基因组序列图谱,构建了该菌株基因组圈图.【结论】肠外致病性大肠杆菌分离株主要分布在B1群,对氨苄西林、林可霉素、杆菌肽以及利福平均耐药,为指导猪源肠外致病性大肠杆菌的防治与临床用药提供依据.

猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

已知多种动物均易被病原性大肠杆菌感染发生大肠杆菌病。在世界各地,大肠杆菌是猪群中很多疾病,包括新生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻、败血症、多发性浆膜炎、乳腺炎、尿路感染的一个重要原因。肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)是一组不同种类的大肠杆菌,不仅可正常定植于肠道,而且能侵入引起菌血症,并诱发败血症或局部肠道外感染,如脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎等[1]。临床上通常使用抗生素进行大肠杆菌病的治疗,但近年来随着抗生素的大量使用,多重耐药大肠杆菌菌株日益增多,给人和动物的安全带来了极大隐患;而ExPEC产生的抗生素耐药性明显高于其他菌群,50%以上的菌株为多重耐药,甚至许多菌株已演化成超级细菌,严重影响了选择有效的抗生素对该类细菌引起的疾病进行防治[2]。由于发病率、死亡率升高和体重降低的增加,以及治疗、疫苗和饲料添加剂的成本增加,ExPEC引起的猪大肠杆菌病导致的经济损失日益显著。

猪β防御素-2对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内外抑菌活性研究

本研究旨在评价猪β防御素2(porcine beta defensin 2,PBD-2)在体内外对猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的抗菌效果,为评估PBD-2在抗生素替代品中的应用前景提供参考。首先,在体外检测不同浓度PBD-2对猪源ExPEC PCN033的杀菌活性。随后,选取5周龄,体重在18~22 g之间的雌性昆明小鼠,检测PBD-2处理组和PBS对照组小鼠(n≥5)感染不同剂量的ExPEC PCN033后的存活率,脑、脾脏、肺脏组织和血液中的载菌量、炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平及脑、脾脏、肺脏组织的病理变化程度。结果表明,PBD-2在25μg/mL时即可在体外极显著抑制猪源ExPEC PCN033的生长(P<0.01),且抑制作用随PBD-2的浓度升高而增强。在体内,与PBS对照组相比,PBD-2处理有效降低了小鼠感染不同剂量ExPEC PCN033后的死亡率。提高PBD-2的治疗剂量对降低小鼠死亡率的效果更加明显。腹腔注射和肌内注射的方式在PBD-2降低小鼠死亡率的效果方面优于口服途径。PBD-2治疗在降低小鼠死亡率的效果方面略低于氯霉素治疗。同时,PBD-2治疗极显著降低了小鼠感染ExPEC PCN03321 h后的脑、脾脏、肺脏组织和血液中的细菌载量(P<0.01),降低了血液中的IL-6、IL-12和IL-1β的含量(P<0.01),减轻了脑、脾脏和肺脏组织的病变程度。上述结果说明PBD-2在体外具有良好的抗猪源ExPEC的活性,同时在小鼠体内对猪源ExPEC感染具有治疗作用,表明PBD-2具有开发成为治疗性药物或者抗生素替代品的潜力。

秦皇岛地区貂源肠外致病性大肠杆菌四环素类耐药表型与基因型相关性分析

为分析秦皇岛地区貂源肠外致病性大肠杆菌对四环素类药物的耐药性及耐药基因之间关系,对秦皇岛地区分离的20株貂源肠外致病性大肠杆菌采用K-B药敏纸片法,选择常见的3种四环素类药物进行耐药性的检测,并通过PCR扩增对其耐药基因进行判定。结果表明:20株肠外致病性大肠杆菌中,多重耐药菌株占75%,多重耐药基因的菌株占100%,耐药基因检出和耐药性结果比较表明,四环素、强力霉素、土霉素对5种耐药基因的符合率在88.89%~100%之间。

肠外致病性大肠杆菌感染对PAVECs细胞死亡相关因子表达的影响

本试验旨在研究猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)对猪血管内皮细胞(PAVECs)的损伤机制。采用ExPEC PPECC042野生株(WT)感染PAVECs 4 h,观察细胞形态变化,随后检测炎症、程序性坏死和焦亡信号通路相关基因的mRNA表达情况。结果表明:ExPEC PPECC042感染PAVECs导致细胞发生皱缩,甚至死亡;ExPEC PPECC042感染PAVECs后,炎症相关基因(IL-8、IL-6、IL-1β)的mRNA表达量均上调(P<0.01或P<0.05);程序性坏死信号通路相关基因(RIP1、MLKL)的mRNA表达量上调(P<0.05);焦亡信号通路相关基因(IL-18、GSDMD、NLRP3)的mRNA表达量均上调(P<0.01或P<0.05)。上述结果表明,ExPEC PPECC042可能通过激活炎症、程序性坏死和焦亡信号通路导致PAVECs发生损伤。

波尔山羊肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

目的:确定某养羊场病死羊的病原和筛选有效的治疗药物。方法:通过常规的细菌分离方法,对病死羊进行细菌分离,并对分离菌进行培养特性、生化试验、特异性毒力基因的PCR检测、小白鼠致病性试验和药物敏感性试验。结果:从病死羊的心、肝、肺和脾脏中分离到7株细菌,均为革兰氏阴性短杆菌、发酵糖产酸产气、液化明胶,符合大肠杆菌的特征;分离菌均可在12h内致死试验小白鼠,具有强致病性;7株分离菌中均扩增到肠外致病性大肠杆菌的特异性毒力基因,序列测定与比对分析结果,分离菌的毒力基因序列与GenBank上登录的肠外致病性大肠杆菌相应序列的相似性在98~100%,可确定分离的大肠杆菌为肠外致病性大肠杆菌;分离的羊肠外致病性大肠杆菌的耐药性较强,仅对阿米卡星、壮观霉素和痢菌净较敏感,而对左氧氟沙星等10种药物低敏或不敏感。结论:分离菌为的羊肠外致病性大肠杆且耐药性较强。

猪源肠外致病性大肠杆菌致脑膜炎机制的研究进展

细菌脑膜炎是由肠外致病性大肠杆菌引起的神经炎症所导致,在全世界范围有较高的发病率和死亡率。随着细菌耐药性增强,以抗生素为主的治疗手段逐渐面临挑战。以临床分离猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033菌株感染为切入点,深入探讨了该病的致病机制,从病原、宿主及致病机制等方面寻找已经发现的毒力因子和靶标蛋白,积极探索非抗生素疗法,寻找新药物靶点等方法以应对细菌性脑膜炎暴发。

CATH-B1抑制肠外致病性大肠杆菌诱导小胶质细胞炎性反应的作用研究

【目的】探究抗菌肽CATH-B1对肠外致病性大肠杆菌RS218感染诱导小胶质细胞(BV2细胞)炎症反应的影响及作用机制。【方法】使用RS218感染小胶质细胞作为炎症模型,试验分为Mock组、RS218感染组和CATH-B1预处理+RS218感染组。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒检测细胞活力,通过菌落计数法检测CATH-B1对细菌生长的影响和细菌的黏附入侵,酶联免疫吸附测定法检测炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-12和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)含量,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)检测IL-1β和IL-6 m RNA表达水平,蛋白质印迹分析(Western blotting)法检测细胞中转录因子蛋白家族核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)P65和P-P65、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)ERK和P-ERK的蛋白表达水平。【结果】CATH-B1显著降低了RS218诱导的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-12的水平,同时显著抑制IL-1β和IL-6 m RNA表达,尽管CATH-B1对细菌的黏附入侵无显著影响,但CATH-B1能够显著抑制P65和ERK磷酸化蛋白的表达。【结论】CATH-B1通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化来发挥抑制炎症作用,为阐明抗菌肽抗神经炎症机制提供了重要依据。

肠外致病性大肠杆菌致病机制及公共卫生学意义

致病性大肠杆菌包括肠致病性大肠杆菌(intestinal pathogenic Escherichia coli, IPEC)和肠外致病性大肠杆菌(extraintestinalpathogenicE.coli,ExPEC),可引起人和动物多种感染性疾病。ExPEC主要在肠道外其他组织脏器定殖并导致感染,包括尿道致病性大肠杆菌(uropathogenicE.coli, UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(newborn meningitis E. coli, NMEC)和禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic E. coli, APEC)。人源ExPEC (UPEC和NMEC)主要引起人尿道感染、肾盂肾炎和新生儿脑膜炎,而APEC可导致禽类的大肠杆菌病,造成家禽业的巨大经济损失。另外,乳腺致病性大肠杆菌(mammary pathogenic E. coli, MPEC)和猪源ExPEC可导致奶牛乳房炎、猪的肺炎及急性败血症等病症。研究发现,ExPEC类菌株在基因组结构上很相似,与IPEC本质区别在于致病机制不同,ExPEC具有很多相同的毒力基因和耐药基因,而且动物源ExPEC的毒力基因和耐药基因可通过食用动物传播给人类,危害人类健康,提示动物源ExPEC是人源ExPEC (NMEC和UPEC)的毒力基因贮库,在公共卫生方面具有重要意义。本文对肠外致病性大肠杆菌的危害、毒力因子、致病机制及公共卫生学意义方面进行综述,有助于全面、深入地认识肠外致病性大肠杆菌。