应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌进行同源性分析

目的了解临床不同来源的鲍曼不动杆菌是否存在同源性,判断其是否存在耐药菌株的克隆播散,追踪其在医院交叉感染的可能途径,以便有效防控鲍曼不动杆菌在医院中传播。方法收集2012年10月至2013年6月临床分离的73株多重耐药鲍曼不动杆菌,用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)对菌株进行同源性分析。结果 73株多重耐药鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR分型分为8个基因型,分别用A、B、C、D、E、F、G、H表示,其中A型31株,B型15株,C型12株,D型8株,E型3株,F型2株,G和H型各为1株。A型为主要的流行株,分布在多个不同的科室。重症监护室(intensive care unit,ICU)分离的菌株存在6个基因型;骨科系统病区存在4个基因型;急诊科有5个基因型;内科发现有6个基因型;外科发现3个基因型。ICU病房环境物体表面共分离出4株鲍曼不动杆菌,其中9号和10号菌株来自于不同患者的床旁,12号和13号来自于护理站电脑键盘。结论临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌存在多个基因型。多重耐药鲍曼不动杆菌存在时间和空间的聚集性。

ERIC-PCR技术在鲍曼不动杆菌基因分型中的应用评估

目的了解仁济医院鲍曼不动杆菌的基因同源性,验证肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)在鲍曼不动杆菌基因分型中的实用性。方法采用琼脂稀释法检测临床分离的81株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);采用ERIC-PCR对81株鲍曼不动杆菌进行基因分型;使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其中的43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌进一步分型,以PFGE分型为参考标准,验证ERIC-PCR在基因分型中的实用性。结果 81株鲍曼不动杆菌对临床常用的13种抗菌药物普遍耐药,只对米诺环素耐药率最低,为30.9%,其次是亚胺培南,为53.1%,对其他抗菌药物的耐药率均>60%。81株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR分型主要为A、B、C、D、E、F 6型,其中A、B、C型为主要的流行株。43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分型为A型41株(A1型29株,A2型12株)、B型1株、C型1株。PFGE分型将其分为5型,A型34株(A1型31株,A2型3株),B型6株,C、D、E分型各1株。结论仁济医院鲍曼不动杆菌存在克隆播散,且主要为耐亚胺培南鲍曼不动杆菌。ERIC-PCR分辨力较强,结果可靠,与PFGE结果具有一定的相关性,是一种简便、快捷的基因分型技术。

青岛两所医院鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因及同源性分析

目的了解青岛市两所医院鲍曼不动杆菌(AB)耐药情况、分布特征,碳青霉烯酶基因携带情况。方法收集两所医院临床分离的145株(A院78株,B院67株)AB进行药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)扩增碳青霉烯酶基因,肠杆菌科基因间一致重复序列(ERIC)-PCR对菌株进行同源性分析。结果 A院AB对临床常用的16种抗菌药物普遍耐药,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(3.85%),其次是米诺环素(16.67%),对其他抗菌药物耐药率均>73%。B院AB对常用的23种抗菌药物普遍耐药,对米诺环素和替加环素均不耐药,对阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率分别为23.88%、38.81%,对其他抗菌药物的耐药率均>64%。两院所有菌株均携带OXA-51基因,A、B两院碳青霉烯耐药组OXA-23基因的携带率分别为86.76%(59/68),56.67%(34/60),差异有统计学意义(χ2=14.53,P<0.001);A院3株菌携带OXA-58基因,B院未检出OXA-58基因。145菌株共分为8个基因型,其中A型71株和E型37株,为主要流行株;A院主要流行A型(46.15%)和E型(41.03%),B院主要流行A型(52.24%)和C型(17.91%)。结论两所医院临床分离的AB耐药情况严重,且存在医院流行,OXA型酶OXA-23、OXA-51基因在介导AB对碳青霉烯类药物耐药中发挥重要作用。

某医院耐碳青霉烯酶类鲍曼不动杆菌耐药基因研究和同源性分析

目的研究本院耐碳青霉烯酶类鲍曼不动杆菌(CRAB)的耐药基因情况,并通过基因检测分析细菌同源性,为防止院内感染、预防性用药提供依据。方法收集无锡市骨科医院2019年1—11月临床分离的56株CRAB菌株,细菌经过分离培养,采用BD Phoenix100全自动微生物分析鉴定仪进行菌株鉴定和药敏试验,并采用PCR的方法检测鲍曼不动杆菌的碳青霉烯类耐药基因,菌株的同源性分析使用肠杆菌科基因组内重复一致序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)方法。结果56株CRAB菌株中有48株(85.7%)OXA51基因阳性,52株(92.9%)OXA23基因阳性,均未检测到OXA24及OXA58基因,对OXA23和OXA51阳性细菌进行同源性分析,38株(80.0%)属于同一基因谱。所有细菌对18种药物耐药率>95.0%,且对美罗培南,亚胺培南的耐药率均>98.0%。结论无锡市骨科医院CRAB主要为OXA23型、OXA51型菌株,且该类细菌呈多重耐药,提示临床应加强医院感染的管理,防止该类鲍曼不动杆菌的暴发传播。

猪源肠出血性大肠杆菌的分离、鉴定及特性研究

目的探讨猪源肠出血性大肠埃希菌病原学特征。方法对所分离的菌株进行生化鉴定、药敏试验,并使用聚合酶链反应(PCR)技术检测毒力基因、耐药基因,同时对致病性的菌株进行外膜蛋白分型、REP-PCR和ERIC-PCR分析。结果从315株大肠杆菌中筛选到山梨醇阴性的EHEC21株,其中含有stx1基因的菌株有4株,含有stx2基因3株,含有eae基因的17株,外膜蛋白分型属于三个型,其中OMP-1型最多,有15株,OMP-2型3株,OMP-3型3株,REP-PCR和ERIC-PCR结果显示这些致病性菌株带型差异性较大,分属于不同的亚群。结论华中地区是养殖业比较发达的地区,而且人均消费猪肉比例也较高,EHEC的存在对人是一种潜在的威胁,应加强监测力度,防止该菌在人群中感染和流行。

大肠埃希菌耐药谱型、基因型和生物膜表型关系研究

以ATCC25922为研究对象,采用改良结晶紫染色,快速银染法和扫描电镜技术对其生物被膜进行定量和定性研究,建立大肠埃希菌生物被膜体外模型,利用优化的模型条件对249株临床分离株进行验证。采用琼脂平板计数法绘制大肠埃希菌浮游菌和被膜菌生长曲线,比较其生长特性的异同。对不同成膜能力的大肠埃希菌临床分离株进行色氨酸定量试验,分析不同培养条件对生物被膜菌胞外基质分泌量的影响。快速银染法和扫描电镜定性研究结果表明,大肠埃希菌形成生物被膜后,形成一种浮游细菌和生物被膜细菌共同分布于同一生存空间内的特殊生理结构;不同稀释度的接种量对细菌生物被膜生物量的变化影响不显著(P>0.05)。249株大肠埃希菌分为强成膜能力、中等成膜能力、弱成膜能力和无成膜能力4个表型,分别占3.21%、18.88%、51.81%、26.10%。

碳青霉烯类耐药大肠埃希菌耐药基因型检测及同源性分析

目的检测临床分离碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的耐药基因型,并对其同源性进行分析,研究其流行情况。方法收集铜陵市人民医院2012年9月至2016年10月临床分离碳青霉烯类耐药大肠埃希菌,采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪进行鉴定,改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型,EDTA双纸片协同试验进行金属酶初筛,聚合酶链反应(PCR)检测碳青霉烯酶基因(bla KPC、bla IMP、bla VIM、bla NDM和bla OXA-48),并对阳性扩增产物进行基因测序;同源性分析采用肠杆菌科基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(ERIC-PCR)。结果共收集碳青霉烯类耐药大肠埃希菌25株,8株改良Hodge试验阳性,13株金属酶初筛试验阳性,其中4株携带bla NDM-1基因,1株携带bla IMP-4基因,1株携带bla KPC-2基因;ERIC-PCR检测分为10种型别。结论碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的耐药机制主要是产金属酶,携带NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌需重点监测;碳青霉烯类耐药大肠埃希菌未在医院引起克隆流行。

多重耐药鲍曼不动杆菌ERIC-PCR的分子流行病学研究

目的监测医院不同病区分离的多重耐药鲍曼不动杆菌属耐药性变迁及基因同源性，为临床治疗和医院感染控制提供依据。方法收集2006—2008年医院临床分离非重复多重耐药鲍曼不动杆菌株23株，采用Kirby—Bauer（K—B）法进行药敏试验，应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应（ERIC—PCR）对菌株进行DNA分型及同源性分析。结果23株鲍曼不动杆菌中，对3种或以上抗茵药耐药有22株；ERIC—PCR谱型表现为7种基因型，其中来源于不同的2个克隆株A型和B型，共占79．3％，且2个克隆株的相似度为72．7％。结论来自多个病区的多重鲍曼不动杆菌对抗生素耐药率高，且具有基因同源性，存在院内克隆传播。

一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的:基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR),寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法:寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果:根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针(1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’)。结论:根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

长沙地区临床分离碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的分子流行病学特征

目的:了解长沙地区临床分离鲍曼不动杆菌的耐药性,探讨碳青霉烯类抗生素耐药菌株的分子流行病学特征。方法:收集长沙地区10所综合性医院2010年3月至2010年12月间临床分离的非重复鲍曼不动杆菌株205株;采用K-B法检测药物敏感性,改良双纸片协同试验检测金属β-内酰胺酶(金属酶),改良Hodge试验筛查碳青霉烯酶;PCR扩增OXA-23,OXA-24,OXA-51,OXA-58及IMP-1和VIM-2型碳青霉烯酶基因,并进行测序分析。应用肠杆菌科基因间一致重复序列聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR,ERIC-PCR)对菌株进行DNA分型及同源性分析。结果:在监测的18种药物中,耐药率超过50%的达14种。其中哌拉西林耐药率最高(80.5%),头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(2.5%)。共筛选出耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌115株,其金属酶表型及基因检测均为阴性;改良Hodge试验阳性71株,其中64株OXA-23基因扩增阳性。115株菌株OXA-51均阳性,未检出OXA-24,OXA-58基因。115株菌株共分为7个ERIC基因型。其中A型19株,B型72株,为主要的流行克隆。结论:长沙地区临床分离鲍曼不动杆菌多重耐药十分严重;产OXA-23和OXA-51型碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的重要机制,且碳青霉烯类耐药菌株存在克隆流行。

产碳青霉烯酶产气肠杆菌的ERIC-PCR图谱分析

目的了解医院临床产碳青霉烯酶产气肠杆菌感染流行情况,为医院感染控制提供帮助。方法对医院检验科微生物实验室在2009年6月-2010年3月临床分离出的16株产碳青霉烯酶产气肠杆菌及1株非产碳青霉烯酶产气肠杆菌,用肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行基因分型。结果 17株菌株分为两个克隆型,其中16株产碳青霉烯酶产气肠杆菌为同一型,而另1株非产酶菌株为另一型。结论医院存在产碳青霉烯酶产气肠杆菌克隆传播现象,医护人员应予以高度关注,并及时采取有效措施。

呼吸重症监护病房2008～2011年鲍曼不动杆菌的耐药性变迁及同源性分析

目的监测呼吸重症监护室(RICU)临床分离的非重复性鲍曼不动杆菌的耐药性变迁趋势及基因同源性状况。方法收集RICU 2008年～2011年临床分离的非重复性鲍曼不动杆菌,采用K-B(Kirby-Bauer)法进行药敏试验,并应用ERIC-PCR进行基因同源性分析。结果①2008年～2011年RICU共分离非重复性鲍曼不动杆菌232株,其中标本来源以痰液为主,占89.66%;②除米诺环素外,对常见抗生素的耐药率均有增加的趋势;对碳青霉烯类抗生素的耐药率已高达85%以上;③所收集的菌株可分为的5个克隆型,其中A型45株,B型61株,C型79株,D型32株,E型15株。结论 RICU检出的鲍曼不动杆菌对抗生素耐药率较高,且具有基因同源性,提示有耐药基因的水平转移。

长沙地区产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的分子流行病学特征

目的了解长沙地区多重耐药铜绿假单胞菌(PA)产金属β-内酰胺酶(MBL)菌株基因型和流行情况。方法收集该地区7所综合医院临床分离的PA,对菌株进行鉴定和药敏试验,采用EDTA协同试验、E-test MBL进行MBL表型筛选,聚合酶连反应(PCR)明确其基因型,肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行同源性分析。结果经EDTA协同和E-test MBL初步筛查,81株PA中仅10株为强阳性;PCR结果显示,18株PA MBL基因阳性,其中IMP-9型11株,IMP-1型1株和VIM-2型6株,未检测出SIM、SPM、GIM和NDM-1基因型。ERIC-PCR分型结果显示,12株产IMP PA存在多个型别,而6株产VIM-2菌株为同一型别。结论长沙地区多重耐药PA以IMP-9和VIM-2基因型最常见。

75株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌ERIC-PCR菌种分型及其主要耐药机制研究

目的探讨碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌同源性及其主要耐药机制。方法收集临床标本946份,分离出碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌,采用琼脂稀释法进行体外药物敏感性试验;采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行耐药菌株同源性分析;筛选其金属β-内酰胺酶并测定主动外排系统表型来分析碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌的耐药性。结果共检测出75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌;ERIC-PCR同源性分析显示75株菌株共分为8个型别,其中A型占34.7%(26株)、B型占22.7%(17株);75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中有13株为产酶株,产酶率为17.3%;外排泵抑制剂MC207110可以使34株美罗培南耐药株的最低抑菌浓度(MIC)较单药时下降4倍或以上,占63.0%。结论本院分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌主要有两种类型,产生碳青霉烯水解酶和外排泵机制是碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌耐药的重要机制。

副猪嗜血杆菌ERIC-PCR分型方法的建立及其应用

利用ERIC序列设计1对引物,分别对PCR反应的模板量、引物浓度、DNA聚合酶用量、dNTPs浓度、退火温度等影响ERIC-PCR扩增的因素进行了探索和优化,以选择最佳的PCR反应体系及反应条件。结果显示,确定的最适引物浓度为0.166～0.333μmol/L,DNA聚合酶的最适浓度为1.0U/μL,模板最适用量为8ng/μL,dNTPs为200μmol/L。利用所建立的副猪嗜血杆菌ERIC-PCR分子生物学分型技术,对临床分离菌株的指纹图谱进行了分析,13个分离菌株的ERIC-PCR指纹图谱与15个标准血清型指纹图谱相比较,可分辨出6种血清型,并与琼脂扩散试验分型方法的结果一致。证实已建立的副猪嗜血杆菌ERIC-PCR分型方法重复性好、可比性高。

泛耐药鲍氏不动杆菌同源性分析及耐消毒剂基因qacE△1研究

目的了解医院感染中广泛耐药鲍氏不动杆菌的同源性及耐消毒剂基因qacEΔ1的携带情况,从而针对性地制定预防控制措施,有效预防医院感染。方法收集2014年住院患者中分离的15株泛耐药鲍氏不动杆菌,采用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行同源性分析,采用聚合酶链反应(PCR)检测其耐消毒剂基因qacEΔ1携带情况。结果 15株医院感染广泛耐药鲍氏不动杆菌经ERIC-PCR分型分A、B两种基因型,A型10株,B型5株;ICU分别分离出A型6株、B型3株;A型其余4株菌株分别分布于PICU(儿科ICU)、整形外科病房、心血管外科病房及神经外科病房;B型其余2株菌株分别分布于胃肠外科病房及骨外科病房;15株医院感染广泛耐药鲍氏不动杆菌均携带耐消毒剂基因qacEΔ1。结论医院感染广泛耐药鲍氏不动杆菌存在菌株的A/B型的克隆流行,其主要分布在基础病情严重、侵入性操作频繁的ICU;医院感染广泛耐药鲍氏不动杆菌耐消毒剂基因qacEΔ1携带率极高。

耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药机制和传播机制研究

目的阐明南方医科大学南方医院耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的耐药机制和传播机制。方法采用聚合酶链反应(PCR)-限制性核酸片段长度多态性分析分型和测序技术对临床分离的59株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌进行整合子Ⅰ、插入序列共同区(ISCR1)和常见碳青霉烯酶基因研究,采用肠杆菌科间重复一致性序列(ERIC)-PCR技术研究传播机制。结果 59株菌株中20株(34%)整合子Ⅰ阳性,17株(29%)整合子Ⅰ可变区阳性;9株(15%)ISCR1阳性,5株(8%)ISCR1可变区阳性且均携带qnrA1和ampR耐药基因盒。1株检出复杂性整合子Ⅰ,3株检出VIM-2基因,2株检出IMP-1基因。ERIC-PCR聚类分析在80%相似水平上聚为52个类群。结论整合子Ⅰ、ISCR1和碳青霉烯酶在铜绿假单胞菌介导多重耐药方面有重要作用,ERIC-PCR是进行铜绿假单胞菌同源性分析的有效方法。

临床血流感染沙门菌的分型及同源性与耐药性分析

目的探讨临床血液感染沙门菌血清分型、基因同源性及耐药质粒和细菌耐药性的关系。方法收集武汉大学中南医院2015～2017年临床血流感染分离的10株沙门菌。采用法国梅里埃Vitek 2Compact全自动鉴定药敏检测系统进行鉴定和药敏实验,按国家标准对沙门菌进行血清学分型,用肠杆菌科基因间重复序列的聚合酶链反应(ERIC-PCR)对其进行基因分型,采用Cluster 3.0软件对PCR扩增产物进行聚类分析。结果 10株沙门菌分为3种血清群,A群1株,B群3株,D群6株,D群是优势血清群,约占60.0%;10株沙门菌中2,3,4,5和8号菌株含有质粒,不含质粒的是1,6,7,9和10号菌株;10株沙门菌对氨苄西林耐药率为80.0%,左氧氟沙星中介率80.0%,对三、四代头孢及碳青霉烯类100.0%敏感,对复方磺胺类敏感率为80.0%;4号和10号菌株、8号和9号菌株的同源性超过80.0%,1号和2号,5号和6号菌株的同源性大于70.0%。结论沙门菌存在耐药质粒,质粒的多少表明耐药程度的高低;沙门菌对氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦耐药率较高,对头孢他啶敏感率高,因此治疗血流感染时可选用三、四代头孢或亚胺培南,采用降阶梯治疗。

神经外科耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌感染暴发调查与控制

目的对某院神经外科一起疑似耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)医院感染暴发事件进行调查,查找感染源及传播途径,提出针对性的预防控制措施。方法对2018年6月12日—7月2日该院神经外科11例CRKP感染患者进行流行病学调查,并采取综合性控制措施控制CRKP感染。结果 11例CRKP感染患者中7例诊断为医院感染。对其中6株CRKP采用肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术进行同源性分析,结果显示,检出A、B两种基因型,2例患者感染的CRKP菌株为A型基因,4例患者(包括3例医院感染患者)感染的CRKP菌株为B型基因。患者环境物体表面,以及部分医务人员手、咽拭子检出CRKP。结论该院存在医院感染暴发,可能是CRKP感染患者的病原体污染环境和医务人员的手导致感染的传播。早期识别感染暴发,并采取手卫生、环境物体表面的清洁消毒以及隔离等措施是控制多重耐药菌医院感染暴发的关键。

对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌外膜蛋白表达及其分子流行病学的研究

目的：分析鲍曼不动杆菌耐药情况、分布特征，以及院内、院间主要克隆株的流行情况；探讨外膜蛋白介导对碳青霉烯类耐药的可能机制。方法收集青岛大学附属医院黄岛院区及解放军第四〇一医院2013年7月至2014年7月鲍曼不动杆菌临床分离株145株，采用纸片扩散法对其进行药敏试验；应用肠杆菌科基因间一致重复序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）对菌株进行DNA分型及同源性分析，并采用PCR扩增外膜蛋白carO基因。随机抽取碳青霉烯耐药组30株鲍曼不动杆菌和敏感组17株鲍曼不动杆菌，用超声破碎及高速离心法提取外膜蛋白，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析外膜蛋白的表达情况。结果145株鲍曼不动杆菌对临床常用16种抗菌药物普遍耐药，其中耐碳青霉烯类128株（耐药率88.3%），多重耐药（MDR）137株，泛耐药（XDR）126株；对米诺环素敏感率最高（79.3%），其次是阿米卡星（40.7%）。碳青霉烯耐药组carO基因阳性率达97.7%（125/128），碳青霉烯敏感组carO基因阳性率达17.6%（3/17）。SDS-PAGE显示，碳青霉烯敏感组17株鲍曼不动杆菌约在相对分子质量47000（16株）、37000（13株）和29000（13株）处有相应条带表达；而耐药组30株在这3处分别有20株、25株、23株呈不同程度的缺失或减弱。聚类分析显示，145株鲍曼不动杆菌共分为8个ERIC基因型，其中A型71株和E型37株，为主要流行株。结论两家医院临床分离鲍曼不动杆菌耐药情况严重且存在院内、院间流行。外膜蛋白carO基因在耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌中广泛存在，外膜蛋白表达的缺失或减弱是鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类的重要机制之一。