应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌进行同源性分析

目的了解临床不同来源的鲍曼不动杆菌是否存在同源性,判断其是否存在耐药菌株的克隆播散,追踪其在医院交叉感染的可能途径,以便有效防控鲍曼不动杆菌在医院中传播。方法收集2012年10月至2013年6月临床分离的73株多重耐药鲍曼不动杆菌,用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)对菌株进行同源性分析。结果 73株多重耐药鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR分型分为8个基因型,分别用A、B、C、D、E、F、G、H表示,其中A型31株,B型15株,C型12株,D型8株,E型3株,F型2株,G和H型各为1株。A型为主要的流行株,分布在多个不同的科室。重症监护室(intensive care unit,ICU)分离的菌株存在6个基因型;骨科系统病区存在4个基因型;急诊科有5个基因型;内科发现有6个基因型;外科发现3个基因型。ICU病房环境物体表面共分离出4株鲍曼不动杆菌,其中9号和10号菌株来自于不同患者的床旁,12号和13号来自于护理站电脑键盘。结论临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌存在多个基因型。多重耐药鲍曼不动杆菌存在时间和空间的聚集性。

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应指纹图谱技术用于细菌分型的研究进展

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)指纹图谱技术利用普遍存在于生物体内的ERIC进行引物设计,通过基因扩增,获得能够表征其基因组结构的产物,该方法简单易行、重复性好、用时短,被广泛应用于细菌基因分型及同源性判别。本文简述细菌分型的研究背景和ERIC-PCR指纹图谱技术的原理及特点,归纳该技术在细菌基因分型方面的优缺点及其在常见食源性致病菌基因分型中的应用现状,并对ERIC-PCR指纹图谱技术应用于乳品企业污染菌溯源的研究进行展望。

重复序列片段基因扩增用于阴沟肠杆菌的分型研究

目的 用重复序列片段基因扩增方法对阴沟肠杆菌进行分型研究。方法 选用肠杆菌科基因间的重复序列 (ERIC)进行扩增 ,对阴沟肠杆菌进行分型研究 ,并与其抗生素耐药特征进行比较。结果 阴沟肠杆菌分成 6种不同基因型 ,不同基因型有不同的耐药特征。结论 本法简便易行 ,重复性好 。

重症监护病区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的主动筛查及基因分析

目的调查重症监护病区(ICU)患者在住院期间碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)主动筛查菌株的分布以及CRE耐药基因的检测和分析。方法收集424例ICU患者直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子样本,采用肉汤增菌法进行CRE阳性病例的主动筛查,全自动药敏分析仪进行体外药敏试验,PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因,通过多位点序列分型(MLST)和肠杆菌基因间重复共有序列PCR分析CRE菌株的同源性关系。结果直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子CRE筛查阳性率分别为12.5%、5.0%和4.2%,CRE菌株主要来自肺炎克雷伯菌(82.6%)、大肠埃希菌(9.8%)和产气肠杆菌(4.3%),CRE菌株对替加环素、头孢他啶阿维巴坦敏感性较好(>90%);92株CRE碳青霉类耐药基因检测,以blaKPC-2亚型(91.3%)为主;MLST分型结果显示76株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)主要为ST11型(69.7%)和ST15型(28.9%);ERIC-PCR扩增结果分析显示,76株肺炎克雷伯菌主要为谱型A(69.7%)和谱型B(28.9%)。结论ICU住院患者CRE主动筛查以blaKPC-2亚型的CRKP为主,MLST分型和ERIC-PCR扩增结果聚类分析发现主要存在两个克隆株传播。

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨,并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数。结果显示40株副溶血性弧菌分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性。根据SPSS10.0软件得出的树状图结果,REP-PCR可以把40株菌分为21个型,分辨力指数可达到0.953,优势菌型为G1型;ERIC-PCR可将40株菌分成4个型,分辨力指数为0.5。研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析,REP-PCR具有较好的分型能力。在两种PCR的DNA指纹图谱中,血清型O1群与O3群主条带均非常相似,表明它们之间亲缘关系密切。

猪源肠出血性大肠杆菌的分离、鉴定及特性研究

目的探讨猪源肠出血性大肠埃希菌病原学特征。方法对所分离的菌株进行生化鉴定、药敏试验,并使用聚合酶链反应(PCR)技术检测毒力基因、耐药基因,同时对致病性的菌株进行外膜蛋白分型、REP-PCR和ERIC-PCR分析。结果从315株大肠杆菌中筛选到山梨醇阴性的EHEC21株,其中含有stx1基因的菌株有4株,含有stx2基因3株,含有eae基因的17株,外膜蛋白分型属于三个型,其中OMP-1型最多,有15株,OMP-2型3株,OMP-3型3株,REP-PCR和ERIC-PCR结果显示这些致病性菌株带型差异性较大,分属于不同的亚群。结论华中地区是养殖业比较发达的地区,而且人均消费猪肉比例也较高,EHEC的存在对人是一种潜在的威胁,应加强监测力度,防止该菌在人群中感染和流行。

ERIC-PCR技术在鲍曼不动杆菌基因分型中的应用评估

目的了解仁济医院鲍曼不动杆菌的基因同源性,验证肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)在鲍曼不动杆菌基因分型中的实用性。方法采用琼脂稀释法检测临床分离的81株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);采用ERIC-PCR对81株鲍曼不动杆菌进行基因分型;使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其中的43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌进一步分型,以PFGE分型为参考标准,验证ERIC-PCR在基因分型中的实用性。结果 81株鲍曼不动杆菌对临床常用的13种抗菌药物普遍耐药,只对米诺环素耐药率最低,为30.9%,其次是亚胺培南,为53.1%,对其他抗菌药物的耐药率均>60%。81株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR分型主要为A、B、C、D、E、F 6型,其中A、B、C型为主要的流行株。43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分型为A型41株(A1型29株,A2型12株)、B型1株、C型1株。PFGE分型将其分为5型,A型34株(A1型31株,A2型3株),B型6株,C、D、E分型各1株。结论仁济医院鲍曼不动杆菌存在克隆播散,且主要为耐亚胺培南鲍曼不动杆菌。ERIC-PCR分辨力较强,结果可靠,与PFGE结果具有一定的相关性,是一种简便、快捷的基因分型技术。

仔猪黄白痢大肠杆菌耐药性检测及ERIC图谱分析

以47株黄白痢临床分离大肠杆菌为材料，通过Kirby-Bauer法检测细菌耐药表型并用PCR扩增I型整合酶基因，进而对不同耐药谱菌株进行以肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应（ERIC-PCR）基因分型并用统计分析软件SPSS16，0聚类．耐药表型检测结果显示：47株大肠杆菌均呈多重耐药，共9种耐药表型；I型整合子阳性菌株检出率为95．7％（45／47）；ERIC-PCR扩增出现稳定可重复的基因指纹图谱，耐9～13种药物菌株（85．1％，40／47）的ERIC指纹图谱分别显示出2种主要谱型，各代表1个猪场的菌株类型．聚类分析提示，相同耐药谱的来自同一猪场和不同猪场分离株的平均相似率分别为68．7％和53．5％，显著高于47株菌的平均相似率37．3％．说明菌株耐药性可能与特定的ERIC指纹图谱相关，ERIC指纹图谱分析可作为考察猪源致病性大肠杆菌多重耐药表型与基因型特征的新视角．

大肠埃希菌耐药谱型、基因型和生物膜表型关系研究

以ATCC25922为研究对象,采用改良结晶紫染色,快速银染法和扫描电镜技术对其生物被膜进行定量和定性研究,建立大肠埃希菌生物被膜体外模型,利用优化的模型条件对249株临床分离株进行验证。采用琼脂平板计数法绘制大肠埃希菌浮游菌和被膜菌生长曲线,比较其生长特性的异同。对不同成膜能力的大肠埃希菌临床分离株进行色氨酸定量试验,分析不同培养条件对生物被膜菌胞外基质分泌量的影响。快速银染法和扫描电镜定性研究结果表明,大肠埃希菌形成生物被膜后,形成一种浮游细菌和生物被膜细菌共同分布于同一生存空间内的特殊生理结构;不同稀释度的接种量对细菌生物被膜生物量的变化影响不显著(P>0.05)。249株大肠埃希菌分为强成膜能力、中等成膜能力、弱成膜能力和无成膜能力4个表型,分别占3.21%、18.88%、51.81%、26.10%。

3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用评价

目的比较3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用。方法采用琼脂稀释法检测重症监护室（ICU）分离的30株鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度（MIC）;分别以肠杆菌科基因间重复一致性序列（ERIC）、基因外回文重复序列（REP）及随机多态性核苷酸序列（RAPD）为引物进行PCR扩增,利用电泳指纹图谱进行基因分型,并进行聚类分析。结果 30株鲍曼不动杆菌仅对头孢哌酮/舒巴坦有较低的耐药率;ERIC-PCR基因分型法的扩增条带最为丰富,能扩增出4∽7个条带,RAPD和REP-PCR扩增条带较少,分别扩增出1∽5和1∽4个条带;3种方法分别将30株鲍曼不动杆菌分为4、4、3个群。结论头孢哌酮/舒巴坦对于多重耐药鲍曼不动杆菌依然有较好的敏感性;本试验初步证实3种方法均可作为鲍曼不动杆菌基因分型的可选方法,ERIC-PCR较另外两种方法扩增条带更丰富,分辨率更好。

青岛两所医院鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因及同源性分析

目的了解青岛市两所医院鲍曼不动杆菌(AB)耐药情况、分布特征,碳青霉烯酶基因携带情况。方法收集两所医院临床分离的145株(A院78株,B院67株)AB进行药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)扩增碳青霉烯酶基因,肠杆菌科基因间一致重复序列(ERIC)-PCR对菌株进行同源性分析。结果 A院AB对临床常用的16种抗菌药物普遍耐药,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(3.85%),其次是米诺环素(16.67%),对其他抗菌药物耐药率均>73%。B院AB对常用的23种抗菌药物普遍耐药,对米诺环素和替加环素均不耐药,对阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率分别为23.88%、38.81%,对其他抗菌药物的耐药率均>64%。两院所有菌株均携带OXA-51基因,A、B两院碳青霉烯耐药组OXA-23基因的携带率分别为86.76%(59/68),56.67%(34/60),差异有统计学意义(χ2=14.53,P<0.001);A院3株菌携带OXA-58基因,B院未检出OXA-58基因。145菌株共分为8个基因型,其中A型71株和E型37株,为主要流行株;A院主要流行A型(46.15%)和E型(41.03%),B院主要流行A型(52.24%)和C型(17.91%)。结论两所医院临床分离的AB耐药情况严重,且存在医院流行,OXA型酶OXA-23、OXA-51基因在介导AB对碳青霉烯类药物耐药中发挥重要作用。

采用ERIC-PCR与PFGE分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异

目的比较脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)与肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERICPCR)检测鲍曼不动杆菌同源性的结果差异。方法分别采用PFGE和ERIC-PCR对我院院内分离的43株鲍曼不动杆菌进行分型检测。结果 43株鲍曼不动杆菌通过PFGE分型得出:A型22株、B型10株、C型3株、D型4株、E型2株、F型1株、G型1株;通过ERIC-PCR得出7种型别:Ⅰ型22株、Ⅱ型10株、Ⅲ型3株、Ⅳ型2株、V型3株、Ⅵ型1株、Ⅶ型2株。2种方法结果相符率为76.8%。我院鲍曼不动杆菌存在克隆株传播。结论 ERIC-PCR操作简便、结果可靠,与PFGE结果一致性高,2种分型方法均适合作为医院进行病原菌流行病学调查的分型检测手段。

副溶血性弧菌肠细菌基因间共有重复序列-PCR分子分型和耐药性、血清型研究

目的对副溶血性弧菌进行ERIC-PCR分子分型、耐药性和血清型相关性研究。方法肠细菌基因间共有重复序列(ERIC)为引物,对40株菌株基因组DNA进行扩增,得到DNA指纹图谱,并利用SPSS13.0统计软件对DNA扩增图谱进行分析,做出聚类图从而分型,并与菌株血清型、耐药性比较分析。结果40株菌用ERIC-PCR分为5个型,分辨力指数为(DI)为0.5;血清分型分为4个型;对8种抗生素中的萘啶酸、头孢噻亏、头孢西丁出现了不同程度的耐药。耐药菌株均出现在ERIC-PCR方法分型A型和血清分型O3型中。结论研究显示ERIC-PCR方法可以用于该菌分型分析,具有较好的分型能力。血清分型与ERIC-PCR方法分型一致。通过ERIC-PCR分型的树状图和血清分型结果推断,血清型O3群菌株很可能起源于血清型O1群菌株,血清型O3群和O1群密切相关。

利用肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)方法对阪崎克罗诺杆菌进行分子分型

阪崎肠杆菌在2008年被重新命名为克罗诺杆菌属的一个新种,是一种条件致病菌,可引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症,严重的可能引起神经系统后遗症和死亡.目前,越来越多的报道证明婴儿配方粉是其主要的传染源和传播媒介.利用肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)方法对43株克罗诺杆菌属菌株和5株肠杆菌属菌株进行分子分型,利用BioNumericus软件对其结果进行分析,如果按照相似性大于80%计算,根据辛普森方程计算该分型方法的分辨率可达到0.984.研究结果表明:ERIC-PCR是一种适用于阪崎克罗诺杆菌的快速分子分型方法,能够对由该菌引起的食品中毒事件进行快速的溯源.

应用ERIC-PCR对多重耐药大肠埃希菌进行基因分型

目的研究ERIC-PCR用于大肠埃希菌基因分型的可靠性。方法102株多重耐药大肠埃希菌采用双纸片扩散法检测ESBLs,用ERIC-PCR进行基因分型。结果102株多重耐药大肠埃希菌可分为六个基因型,主要为I和II型,分别为40株和24株。结论ERIC-PCR可用于大肠埃希菌的基因分型。

进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌分子分型方法的比较研究

为研究来自不同地域幼虫芽孢杆菌的进化关系,建立其分子分型方法,对来自11个国家和地区的50株幼虫芽孢杆菌分离株进行MLST分型分析,并与ERIC分型比较。结果显示,ERIC法将50株分离株分为ERICⅠ、ERICⅡ与ERICⅣ型,但不能区分不同区域菌株;MLST法将菌株分为ST1至ST8共8种序列型,其中ST1为优势型,占比高且分布广泛;其次为ST5(主要为加拿大分离株),ST3(澳大利亚分离株),ST4(法国与匈牙利分离株),ST6(新西兰分离株),ST2(西班牙分离株),ST7(匈牙利分离株)和ST8(澳大利亚分离株)。与ERIC相比,MLST可以对不同地域的幼虫芽孢杆菌进行有效分型,具有更高的分辨率,可作为后续进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌流行病学调查的工具。

碳青霉烯类非敏感肠杆菌科细菌分子流行病学研究

目的调查碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌的流行情况,并研究其耐药性传播方式。方法收集本院临床分离的碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌34株,用Vitek2 Compact系统进行细菌鉴定和常规药敏检测,改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,用肠杆菌基因间重复一致序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)-PCR进行分子流行病学调查。PCR扩增Int 1、Int 2、Int 3整合酶基因,质粒接合和消除试验研究细菌耐药基因的传播方式。结果 19株细菌改良Hodge试验阳性。来自7个不同科室的12株大肠埃希菌和17株阴沟肠杆菌可以分为3种和6种基因型,来自4个不同科室的5株肺炎克雷伯菌只有1种基因型。27株菌Int 1基因阳性,未检出Int 2和Int 3基因。除骨科1株阴沟肠杆菌外,其余33株细菌质粒消除和接合试验均成功。结论本院碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌主要发生在外科各科室;所有肺炎克雷伯菌和泌尿外科大肠埃希菌属同一基因型,表明此类菌株呈局部流行;碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌耐药性主要通过质粒传播。

猕猴肠道菌群基因组DNA提取及其ERIC-PCR分析

本试验采用反复冻融法、酶裂解法和试剂盒法分别提取猕猴肠道菌群的总DNA,根据提取的DNA浓度和纯度最终确定酶裂解法为较好的方法。将酶裂解法提取的DNA进行ERIC-PCR扩增,结果显示:同年龄组猕猴粪样的ERIC条带数量和位置变化不大;幼年组猕猴的菌群种类较丰富,但优势菌群不明显;青年组猕猴的菌群种类和优势菌群最为丰富;老年组猕猴的菌群种类最少。

万古霉素非敏感肠球菌的筛选和基因型分析

目的对实验室保存的325株肠球菌进行万古霉素非敏感肠球菌筛选,并对筛选出的菌株进行耐药表型、耐药基因型、菌株同源性分析。方法采用琼脂平皿二倍稀释法筛选万古霉素非敏感肠球菌,并检测菌株对替考拉宁的敏感性;采用PCR方法检测万古霉素非敏感肠球菌的耐药基因型;通过肠道细菌基因间重复一致序列(ERIC)PCR技术、脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术、多位点序列分型(MLST)技术进行菌株的同源性分析。结果从325株临床分离肠球菌中共筛选出17株万古霉素非敏感肠球菌,包括1株粪肠球菌、11株屎肠球菌和5株鹑鸡肠球菌。其中1株粪肠球菌和11株屎肠球菌对万古霉素显示高水平耐药,对替考拉宁耐药或中介耐药,PCR检测结果显示van A型;5株鹑鸡肠球菌对万古霉素中介耐药,对替考拉宁敏感,PCR检测结果显示van C1型。ERIC同源性分析显示同基因型的大多数菌株显示相似的分型;PFGE同源性分析显示,17株临床万古霉素非敏感肠球菌分型不同,不属于单克隆流行播散;MLST同源性分析显示,1株临床万古霉素非敏感粪肠球菌属于ST4,11株临床万古霉素非敏感屎肠球菌共分为6个ST型,其中4株属于ST78,是屎肠球菌出现频率最高的ST型。结论我国万古霉素耐药菌在粪肠球菌中分离率较低,但屎肠球菌中万古霉素耐药情况较严重,并且耐药菌株携带易于传播和转移的van A基因。同源性分析结果显示万古霉素耐药存在同源性传播的可能性。

耐碳青霉烯类大肠埃希菌产碳青霉烯酶基因型和同源性检测及分析

目的检测并分析耐碳青霉烯类大肠埃希菌(CRECO)产碳青霉烯酶基因型及其同源性。方法对2020年湖北省十堰市3家三甲医院临床分离的31株CRECO采用MALDI-TOF质谱仪进行菌种再鉴定,K-B纸片扩散法和E test条复核药敏结果,得到23株CRECO。采用碳青霉烯类药物的协同试验初筛产碳青霉烯酶基因型,PCR法检测8种常见碳青霉烯酶基因型并对阳性产物测序,用肠杆菌科基因间重复一致序列(ERIC)PCR法检测其同源性。结果23株CRECO中,9株产NDM-5酶,6株产KPC-2酶,2株产IMP-4酶。产碳青霉烯酶的大肠埃希菌大多从呼吸系统标本中分离出,多数来自呼吸重症病房,大多数为70岁以上老年患者,且患者经历过机械辅助通气、留置尿管或外科手术等侵入性操作。23株CRECO只对少数几种抗生素(阿米卡星、庆大霉素、复方新诺明)耐药率较低。同源性分析结果显示,本地区CRECO分7型,未见覆盖本地区的优势型别。结论十堰地区CRECO耐药机制复杂,产酶基因型主要是NDM-5和KPC-2基因,菌株对多种抗生素耐药。未发现本地区的克隆菌株爆发流行。