重复序列片段基因扩增用于阴沟肠杆菌的分型研究

目的 用重复序列片段基因扩增方法对阴沟肠杆菌进行分型研究。方法 选用肠杆菌科基因间的重复序列 (ERIC)进行扩增 ,对阴沟肠杆菌进行分型研究 ,并与其抗生素耐药特征进行比较。结果 阴沟肠杆菌分成 6种不同基因型 ,不同基因型有不同的耐药特征。结论 本法简便易行 ,重复性好 。

进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌分子分型方法的比较研究

为研究来自不同地域幼虫芽孢杆菌的进化关系,建立其分子分型方法,对来自11个国家和地区的50株幼虫芽孢杆菌分离株进行MLST分型分析,并与ERIC分型比较。结果显示,ERIC法将50株分离株分为ERICⅠ、ERICⅡ与ERICⅣ型,但不能区分不同区域菌株;MLST法将菌株分为ST1至ST8共8种序列型,其中ST1为优势型,占比高且分布广泛;其次为ST5(主要为加拿大分离株),ST3(澳大利亚分离株),ST4(法国与匈牙利分离株),ST6(新西兰分离株),ST2(西班牙分离株),ST7(匈牙利分离株)和ST8(澳大利亚分离株)。与ERIC相比,MLST可以对不同地域的幼虫芽孢杆菌进行有效分型,具有更高的分辨率,可作为后续进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌流行病学调查的工具。

猕猴肠道菌群基因组DNA提取及其ERIC-PCR分析

本试验采用反复冻融法、酶裂解法和试剂盒法分别提取猕猴肠道菌群的总DNA,根据提取的DNA浓度和纯度最终确定酶裂解法为较好的方法。将酶裂解法提取的DNA进行ERIC-PCR扩增,结果显示:同年龄组猕猴粪样的ERIC条带数量和位置变化不大;幼年组猕猴的菌群种类较丰富,但优势菌群不明显;青年组猕猴的菌群种类和优势菌群最为丰富;老年组猕猴的菌群种类最少。

重症监护病区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的主动筛查及基因分析

目的调查重症监护病区(ICU)患者在住院期间碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)主动筛查菌株的分布以及CRE耐药基因的检测和分析。方法收集424例ICU患者直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子样本,采用肉汤增菌法进行CRE阳性病例的主动筛查,全自动药敏分析仪进行体外药敏试验,PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因,通过多位点序列分型(MLST)和肠杆菌基因间重复共有序列PCR分析CRE菌株的同源性关系。结果直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子CRE筛查阳性率分别为12.5%、5.0%和4.2%,CRE菌株主要来自肺炎克雷伯菌(82.6%)、大肠埃希菌(9.8%)和产气肠杆菌(4.3%),CRE菌株对替加环素、头孢他啶阿维巴坦敏感性较好(>90%);92株CRE碳青霉类耐药基因检测,以blaKPC-2亚型(91.3%)为主;MLST分型结果显示76株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)主要为ST11型(69.7%)和ST15型(28.9%);ERIC-PCR扩增结果分析显示,76株肺炎克雷伯菌主要为谱型A(69.7%)和谱型B(28.9%)。结论ICU住院患者CRE主动筛查以blaKPC-2亚型的CRKP为主,MLST分型和ERIC-PCR扩增结果聚类分析发现主要存在两个克隆株传播。

大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响

应用肠杆菌基因间重复共有序列基因扩增(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)和聚合酶链式反应--变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)研究大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响。灌胃红星二锅头建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,ERIC-PCR和PCR-DGGE电泳获得肠道菌群指纹图谱,分析肠道菌群的相似性和多样性并鉴定优势条带序列。ERIC-PCR结果表明急性酒精性肝损伤模型小鼠肠道菌群结构发生明显改变,以360 bp的条带为优势条带,610 bp左右的条带强度减弱,大蒜多糖预防给药组中360 bp左右的条带强度减弱。PCR-DGGE结果显示急性酒精性肝损伤的小鼠肠道菌群多样性指数降低,优杆菌属和乳酸菌属细菌明显减少。大蒜多糖高剂量组的多样性指数和均匀度指数最高,优杆菌属和乳酸菌属细菌增多。大蒜多糖可以促进肠道中优杆菌属和乳酸菌属生长,调节急性酒精性肝损伤伴有的肠道菌群失调。

肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性分析及ERIC-PCR分型

目的：了解肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性情况以及各生产环节菌株间亲缘关系,为临床用药及菌株追踪溯源提供依据。方法：采用微量肉汤稀释法对171株肠炎沙门氏菌进行13种抗菌药物药敏实验;采用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR）法对33株不同生产环节耐药菌株进行分子分型;采用SPSS 20.0软件、Gel-Pro Analyer 4.0和NTSYS pc 2.1软件进行分析。结果：171株肠炎沙门氏菌对13种药物耐药情况不同,其中对氨苄西林耐药情况最严重,耐药率高达90.06%,对恩诺沙星、氧氟沙星最为敏感,耐药率均仅为5.26%;不同环节间耐药性差异极显著（P〈0.01）;多重耐药率高达95.32%,共有26种耐药谱型。不同环节的33株肠炎沙门氏菌分为4种（Ⅰ~Ⅳ）基因型,遗传相似性在66%~100%,Ⅰ型为优势基因型;基因型相同的菌株耐药谱不一定相同,反之,耐药谱相同的菌株基因型不一定相同。结论：肉鸡生产链条中沙门氏菌对多种抗菌药物产生耐药性,且耐药谱种类繁多;沙门氏菌能够沿着生产链进行水平传播,肉鸡场环节菌株基因型相对复杂,菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性。

UC和其它肠道疾病肠道菌丛结构的ERIC-PCR指纹图谱分析

目的建立溃疡性结肠炎(UC)和其它肠道疾病的肠道细菌DNA指纹图谱以分析其肠道菌丛的整体差异。方法采集19例UC、11例急性胃肠炎、6例IBS患者及11例正常对照者的粪便标本,提取肠道细菌总DNA;应用ERIC-PCR技术建立各组肠道细菌DNA指纹图谱,分析UC、急性胃肠炎、IBS患者及正常对照者的肠道菌丛的整体差异。结果经分析发现四组研究对象的肠道菌丛存在整体差异:UC组ERIC-PCR指纹图谱电泳DNA条带较少,IBS组、急性胃肠炎组和正常对照组ERIC-PCR指纹图谱电泳DNA条带多;UC组中有18个样本主带分布非常一致,均出现在约0.7 kb处,急性胃肠炎组主带分布也非常一致,均出现在约1.1 kb和0.8 kb处;正常对照组和IBS组主带位置无统一趋势。结论与IBS、急性胃肠炎和正常对照组相比较,UC组肠道优势菌群种类少;UC组和急性胃肠炎组各有分布较一致的主带;UC可能存在较单一的肠道优势细菌,推测其发病机制可能与特定的肠道优势细菌感染有关。

2型糖尿病合并急性胰腺炎大鼠肠道微生物ERIC-PCR指纹图谱的分析

目的应用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacteria repetitive intergenic consen sussequencespolymerase chain reaction,ERIC-PCR)技术检测2型糖尿病合并急性胰腺炎后大鼠肠道内菌群的数量及多样性的改变情况。方法40只10周龄雄性大鼠,其中20只Wistar大鼠,随机分为空白对照组(QB组)、单纯急性胰腺炎大鼠模型(AP组);20只Goto-kakisaki自发性2型糖尿病大鼠(GK大鼠)随机分为2型糖尿病组(DM组)、2型糖尿病合并急性胰腺炎组(DAP组);每组10只,分别标号。其中AP组、DAP组作为造模组。检测DAP组和AP组24 h血清胰淀粉酶活性水平和随机血糖。48 h后:(1)处死各组大鼠,取胰腺观察病理损伤程度并以改良Schmidt法为标准进行胰腺组织病理评分。(2)采集各组大鼠新鲜粪便,并提取新鲜大鼠粪便基因组,进行基因组扩增,将PCR产物点样于琼脂糖凝胶,制作目的 ERIC-PCR指纹图谱;(3)同时将采集的新鲜粪便处理后制成不同浓度梯度细菌悬浊液,接种于BBL琼脂培养基、MRS肉汤培养基、SS琼脂培养基、MAC琼脂培养基上培养并计数。结果 (1)AP组、DAP组病死率分别是20%(2/10)和40%(4/10),QB组、DM组无死亡,DAP组病理评分最高;(2)DAP组术后24 h血糖水平较AP组升高,差异具有统计学意义(t=2.24,P<0.05);DAP组术后24 h血淀粉酶较AP组无明显变化,两组比较差异无统计学意义(t=6.40,P=0.53);(3)肠道菌群多样性指数、ERIC-PCR指纹图谱及相似性聚类分析显示,DAP组特征性条带数量减少且肠道菌群多样性改变;(4)4组间肠道微生物菌群比较,差异具有统计学意义。进一步两两比较,DAP组的双歧杆菌和乳酸杆菌低于QB组和AP组,差异具有统计学意义(P<0.05);DAP组的大肠杆菌和变形杆菌高于QB组和AP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 (1)2型糖尿病大鼠并发急性胰腺炎后肠道菌群的结构均发生改变,菌群多样性减少;益生菌减少及条件致病菌增多;(2)肠道菌群的变化参与2型糖尿病合并急性胰腺炎的病程进展。

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

铜绿假单胞菌临床感染特征及其产超广谱β-内酰胺酶危险因素分析

目的探讨郑州市2家医院临床分离铜绿假单胞菌的感染特征及其与产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的关系。方法选取2016年1月至2017年8月郑州市2家医院临床标本中分离出的51株非克隆铜绿假单胞菌,采用K-B纸片扩散法筛选出产ESBLs铜绿假单胞菌,采用肠杆菌基因间重复共有序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)对51株铜绿假单胞菌株进行同源性分析,采用单因素和Logistic回归分析探讨铜绿假单胞菌产ESBLs的危险因素。结果51株铜绿假单胞菌共检测出产ESBLs菌株22株,产ESBLs菌株阳性率为43.1%。51株铜绿假单胞菌ERIC-PCR同源性分析显示I型29株,Ⅱ型17株,Ⅲ型5株。单因素分析显示,内科来源的菌株中产ESBLs阳性菌株所占比例(59.2%)显著高于ICU来源的菌株(20.0%)(P<0.05),ERIC-PCR分型I型菌株产ESBLs阳性率(55.2%)显著高于Ⅱ型菌株(23.5%)及Ⅱ、Ⅲ型菌株之和(27.3%)(P<0.05)。Logistic多因素分析显示,ERIC-PCR分型I型、内科来源菌株为铜绿假单胞菌产ESBLs的危险因素(P<0.05)。结论郑州地区铜绿假单胞菌感染以内科多见,性别分布上以男性患者为主,同源性分析以Ⅰ型和Ⅱ型为主,内科来源及ERIC-PCR分型Ⅰ型菌株是郑州地区医院内铜绿假单胞菌产生ESBLs的危险因素。

奇异变形杆菌临床分离株的药敏分析及ERIC-PCR分型

目的了解奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)耐药性情况及菌株间亲缘关系,为临床用药及菌株追踪溯源提供依据。方法收集医院2011年-2015年部分临床标本中分离、鉴定的77株奇异变形杆菌,采用药敏纸片扩散法进行20种抗菌药物药敏试验,并采用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)法对77株耐药菌株进行分子分型。结果检测的20种抗菌药物中,奇异变形杆菌对红霉素耐药情况最严重,耐药率为97.40%,对头孢西丁和头孢吡肟最为敏感,耐药率均仅为2.60%和7.79%;77株奇异变形杆菌可划分为16(I^XVI)个基因簇,54株菌株相似性>70%。结论奇异变形杆菌临床分离株对多种抗菌药物产生耐药性,且耐药谱种类繁多。从分型结果得出,奇异变形杆菌菌株基因型相对多样,菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性。

南方食品中沙门氏菌污染调查及分型

【目的】系统调查我国南方代表性地区食品中沙门氏菌污染情况,并对分离株进行血清分型和肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链式反应(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR)分型研究,为溯源和控制食品中沙门氏菌的污染提供数据。【方法】采用定性法和最大可能数(Most Probable Number,MPN)法对七大类食品(肉与肉制品、水产品、速冻食品、熟食、蔬菜、乳制品和食用菌)中的沙门氏菌进行检测。利用血清分型和分子分型确定南方沙门氏菌血清型的分布和优势血清型,研究分离株的遗传多样性。【结果】从400份食品样品共检出75份沙门氏菌阳性样品,污染率为18.8%(75/400)。其中,97.3%(73/75)的阳性样品污染水平均低于10 MPN/g。对93株分离株进行血清分型,分属9个群、29种血清型。优势血清型为德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)。利用ERIC-PCR对96株沙门氏菌(包括93株分离株和3株标准株)进行分型研究发现,在相似系数为0.75时可分为15个聚类簇,56种型别,分离株的基因型别呈现多样性。【结论】南方食品中沙门氏菌的污染率较高,但污染水平低。S.Derby和S.Typhimurium为优势血清型。初步建立了沙门氏菌ERIC-PCR指纹图谱数据库,南方食品中沙门氏菌的血清型和基因型呈现多样性。