应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌进行同源性分析

目的了解临床不同来源的鲍曼不动杆菌是否存在同源性,判断其是否存在耐药菌株的克隆播散,追踪其在医院交叉感染的可能途径,以便有效防控鲍曼不动杆菌在医院中传播。方法收集2012年10月至2013年6月临床分离的73株多重耐药鲍曼不动杆菌,用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)对菌株进行同源性分析。结果 73株多重耐药鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR分型分为8个基因型,分别用A、B、C、D、E、F、G、H表示,其中A型31株,B型15株,C型12株,D型8株,E型3株,F型2株,G和H型各为1株。A型为主要的流行株,分布在多个不同的科室。重症监护室(intensive care unit,ICU)分离的菌株存在6个基因型;骨科系统病区存在4个基因型;急诊科有5个基因型;内科发现有6个基因型;外科发现3个基因型。ICU病房环境物体表面共分离出4株鲍曼不动杆菌,其中9号和10号菌株来自于不同患者的床旁,12号和13号来自于护理站电脑键盘。结论临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌存在多个基因型。多重耐药鲍曼不动杆菌存在时间和空间的聚集性。

猪源肠出血性大肠杆菌的分离、鉴定及特性研究

目的探讨猪源肠出血性大肠埃希菌病原学特征。方法对所分离的菌株进行生化鉴定、药敏试验,并使用聚合酶链反应(PCR)技术检测毒力基因、耐药基因,同时对致病性的菌株进行外膜蛋白分型、REP-PCR和ERIC-PCR分析。结果从315株大肠杆菌中筛选到山梨醇阴性的EHEC21株,其中含有stx1基因的菌株有4株,含有stx2基因3株,含有eae基因的17株,外膜蛋白分型属于三个型,其中OMP-1型最多,有15株,OMP-2型3株,OMP-3型3株,REP-PCR和ERIC-PCR结果显示这些致病性菌株带型差异性较大,分属于不同的亚群。结论华中地区是养殖业比较发达的地区,而且人均消费猪肉比例也较高,EHEC的存在对人是一种潜在的威胁,应加强监测力度,防止该菌在人群中感染和流行。

仔猪黄白痢大肠杆菌耐药性检测及ERIC图谱分析

以47株黄白痢临床分离大肠杆菌为材料，通过Kirby-Bauer法检测细菌耐药表型并用PCR扩增I型整合酶基因，进而对不同耐药谱菌株进行以肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应（ERIC-PCR）基因分型并用统计分析软件SPSS16，0聚类．耐药表型检测结果显示：47株大肠杆菌均呈多重耐药，共9种耐药表型；I型整合子阳性菌株检出率为95．7％（45／47）；ERIC-PCR扩增出现稳定可重复的基因指纹图谱，耐9～13种药物菌株（85．1％，40／47）的ERIC指纹图谱分别显示出2种主要谱型，各代表1个猪场的菌株类型．聚类分析提示，相同耐药谱的来自同一猪场和不同猪场分离株的平均相似率分别为68．7％和53．5％，显著高于47株菌的平均相似率37．3％．说明菌株耐药性可能与特定的ERIC指纹图谱相关，ERIC指纹图谱分析可作为考察猪源致病性大肠杆菌多重耐药表型与基因型特征的新视角．

大肠埃希菌耐药谱型、基因型和生物膜表型关系研究

以ATCC25922为研究对象,采用改良结晶紫染色,快速银染法和扫描电镜技术对其生物被膜进行定量和定性研究,建立大肠埃希菌生物被膜体外模型,利用优化的模型条件对249株临床分离株进行验证。采用琼脂平板计数法绘制大肠埃希菌浮游菌和被膜菌生长曲线,比较其生长特性的异同。对不同成膜能力的大肠埃希菌临床分离株进行色氨酸定量试验,分析不同培养条件对生物被膜菌胞外基质分泌量的影响。快速银染法和扫描电镜定性研究结果表明,大肠埃希菌形成生物被膜后,形成一种浮游细菌和生物被膜细菌共同分布于同一生存空间内的特殊生理结构;不同稀释度的接种量对细菌生物被膜生物量的变化影响不显著(P>0.05)。249株大肠埃希菌分为强成膜能力、中等成膜能力、弱成膜能力和无成膜能力4个表型,分别占3.21%、18.88%、51.81%、26.10%。

ERIC-PCR技术在鲍曼不动杆菌基因分型中的应用评估

目的了解仁济医院鲍曼不动杆菌的基因同源性,验证肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)在鲍曼不动杆菌基因分型中的实用性。方法采用琼脂稀释法检测临床分离的81株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);采用ERIC-PCR对81株鲍曼不动杆菌进行基因分型;使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其中的43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌进一步分型,以PFGE分型为参考标准,验证ERIC-PCR在基因分型中的实用性。结果 81株鲍曼不动杆菌对临床常用的13种抗菌药物普遍耐药,只对米诺环素耐药率最低,为30.9%,其次是亚胺培南,为53.1%,对其他抗菌药物的耐药率均>60%。81株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR分型主要为A、B、C、D、E、F 6型,其中A、B、C型为主要的流行株。43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分型为A型41株(A1型29株,A2型12株)、B型1株、C型1株。PFGE分型将其分为5型,A型34株(A1型31株,A2型3株),B型6株,C、D、E分型各1株。结论仁济医院鲍曼不动杆菌存在克隆播散,且主要为耐亚胺培南鲍曼不动杆菌。ERIC-PCR分辨力较强,结果可靠,与PFGE结果具有一定的相关性,是一种简便、快捷的基因分型技术。

3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用评价

目的比较3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用。方法采用琼脂稀释法检测重症监护室（ICU）分离的30株鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度（MIC）;分别以肠杆菌科基因间重复一致性序列（ERIC）、基因外回文重复序列（REP）及随机多态性核苷酸序列（RAPD）为引物进行PCR扩增,利用电泳指纹图谱进行基因分型,并进行聚类分析。结果 30株鲍曼不动杆菌仅对头孢哌酮/舒巴坦有较低的耐药率;ERIC-PCR基因分型法的扩增条带最为丰富,能扩增出4∽7个条带,RAPD和REP-PCR扩增条带较少,分别扩增出1∽5和1∽4个条带;3种方法分别将30株鲍曼不动杆菌分为4、4、3个群。结论头孢哌酮/舒巴坦对于多重耐药鲍曼不动杆菌依然有较好的敏感性;本试验初步证实3种方法均可作为鲍曼不动杆菌基因分型的可选方法,ERIC-PCR较另外两种方法扩增条带更丰富,分辨率更好。

青岛两所医院鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因及同源性分析

目的了解青岛市两所医院鲍曼不动杆菌(AB)耐药情况、分布特征,碳青霉烯酶基因携带情况。方法收集两所医院临床分离的145株(A院78株,B院67株)AB进行药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)扩增碳青霉烯酶基因,肠杆菌科基因间一致重复序列(ERIC)-PCR对菌株进行同源性分析。结果 A院AB对临床常用的16种抗菌药物普遍耐药,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(3.85%),其次是米诺环素(16.67%),对其他抗菌药物耐药率均>73%。B院AB对常用的23种抗菌药物普遍耐药,对米诺环素和替加环素均不耐药,对阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率分别为23.88%、38.81%,对其他抗菌药物的耐药率均>64%。两院所有菌株均携带OXA-51基因,A、B两院碳青霉烯耐药组OXA-23基因的携带率分别为86.76%(59/68),56.67%(34/60),差异有统计学意义(χ2=14.53,P<0.001);A院3株菌携带OXA-58基因,B院未检出OXA-58基因。145菌株共分为8个基因型,其中A型71株和E型37株,为主要流行株;A院主要流行A型(46.15%)和E型(41.03%),B院主要流行A型(52.24%)和C型(17.91%)。结论两所医院临床分离的AB耐药情况严重,且存在医院流行,OXA型酶OXA-23、OXA-51基因在介导AB对碳青霉烯类药物耐药中发挥重要作用。

采用ERIC-PCR与PFGE分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异

目的比较脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)与肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERICPCR)检测鲍曼不动杆菌同源性的结果差异。方法分别采用PFGE和ERIC-PCR对我院院内分离的43株鲍曼不动杆菌进行分型检测。结果 43株鲍曼不动杆菌通过PFGE分型得出:A型22株、B型10株、C型3株、D型4株、E型2株、F型1株、G型1株;通过ERIC-PCR得出7种型别:Ⅰ型22株、Ⅱ型10株、Ⅲ型3株、Ⅳ型2株、V型3株、Ⅵ型1株、Ⅶ型2株。2种方法结果相符率为76.8%。我院鲍曼不动杆菌存在克隆株传播。结论 ERIC-PCR操作简便、结果可靠,与PFGE结果一致性高,2种分型方法均适合作为医院进行病原菌流行病学调查的分型检测手段。

利用肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)方法对阪崎克罗诺杆菌进行分子分型

阪崎肠杆菌在2008年被重新命名为克罗诺杆菌属的一个新种,是一种条件致病菌,可引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症,严重的可能引起神经系统后遗症和死亡.目前,越来越多的报道证明婴儿配方粉是其主要的传染源和传播媒介.利用肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)方法对43株克罗诺杆菌属菌株和5株肠杆菌属菌株进行分子分型,利用BioNumericus软件对其结果进行分析,如果按照相似性大于80%计算,根据辛普森方程计算该分型方法的分辨率可达到0.984.研究结果表明:ERIC-PCR是一种适用于阪崎克罗诺杆菌的快速分子分型方法,能够对由该菌引起的食品中毒事件进行快速的溯源.

应用ERIC-PCR对多重耐药大肠埃希菌进行基因分型

目的研究ERIC-PCR用于大肠埃希菌基因分型的可靠性。方法102株多重耐药大肠埃希菌采用双纸片扩散法检测ESBLs,用ERIC-PCR进行基因分型。结果102株多重耐药大肠埃希菌可分为六个基因型,主要为I和II型,分别为40株和24株。结论ERIC-PCR可用于大肠埃希菌的基因分型。

碳青霉烯类非敏感肠杆菌科细菌分子流行病学研究

目的调查碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌的流行情况,并研究其耐药性传播方式。方法收集本院临床分离的碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌34株,用Vitek2 Compact系统进行细菌鉴定和常规药敏检测,改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,用肠杆菌基因间重复一致序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)-PCR进行分子流行病学调查。PCR扩增Int 1、Int 2、Int 3整合酶基因,质粒接合和消除试验研究细菌耐药基因的传播方式。结果 19株细菌改良Hodge试验阳性。来自7个不同科室的12株大肠埃希菌和17株阴沟肠杆菌可以分为3种和6种基因型,来自4个不同科室的5株肺炎克雷伯菌只有1种基因型。27株菌Int 1基因阳性,未检出Int 2和Int 3基因。除骨科1株阴沟肠杆菌外,其余33株细菌质粒消除和接合试验均成功。结论本院碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌主要发生在外科各科室;所有肺炎克雷伯菌和泌尿外科大肠埃希菌属同一基因型,表明此类菌株呈局部流行;碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌耐药性主要通过质粒传播。

万古霉素非敏感肠球菌的筛选和基因型分析

目的对实验室保存的325株肠球菌进行万古霉素非敏感肠球菌筛选,并对筛选出的菌株进行耐药表型、耐药基因型、菌株同源性分析。方法采用琼脂平皿二倍稀释法筛选万古霉素非敏感肠球菌,并检测菌株对替考拉宁的敏感性;采用PCR方法检测万古霉素非敏感肠球菌的耐药基因型;通过肠道细菌基因间重复一致序列(ERIC)PCR技术、脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术、多位点序列分型(MLST)技术进行菌株的同源性分析。结果从325株临床分离肠球菌中共筛选出17株万古霉素非敏感肠球菌,包括1株粪肠球菌、11株屎肠球菌和5株鹑鸡肠球菌。其中1株粪肠球菌和11株屎肠球菌对万古霉素显示高水平耐药,对替考拉宁耐药或中介耐药,PCR检测结果显示van A型;5株鹑鸡肠球菌对万古霉素中介耐药,对替考拉宁敏感,PCR检测结果显示van C1型。ERIC同源性分析显示同基因型的大多数菌株显示相似的分型;PFGE同源性分析显示,17株临床万古霉素非敏感肠球菌分型不同,不属于单克隆流行播散;MLST同源性分析显示,1株临床万古霉素非敏感粪肠球菌属于ST4,11株临床万古霉素非敏感屎肠球菌共分为6个ST型,其中4株属于ST78,是屎肠球菌出现频率最高的ST型。结论我国万古霉素耐药菌在粪肠球菌中分离率较低,但屎肠球菌中万古霉素耐药情况较严重,并且耐药菌株携带易于传播和转移的van A基因。同源性分析结果显示万古霉素耐药存在同源性传播的可能性。

耐碳青霉烯类大肠埃希菌产碳青霉烯酶基因型和同源性检测及分析

目的检测并分析耐碳青霉烯类大肠埃希菌(CRECO)产碳青霉烯酶基因型及其同源性。方法对2020年湖北省十堰市3家三甲医院临床分离的31株CRECO采用MALDI-TOF质谱仪进行菌种再鉴定,K-B纸片扩散法和E test条复核药敏结果,得到23株CRECO。采用碳青霉烯类药物的协同试验初筛产碳青霉烯酶基因型,PCR法检测8种常见碳青霉烯酶基因型并对阳性产物测序,用肠杆菌科基因间重复一致序列(ERIC)PCR法检测其同源性。结果23株CRECO中,9株产NDM-5酶,6株产KPC-2酶,2株产IMP-4酶。产碳青霉烯酶的大肠埃希菌大多从呼吸系统标本中分离出,多数来自呼吸重症病房,大多数为70岁以上老年患者,且患者经历过机械辅助通气、留置尿管或外科手术等侵入性操作。23株CRECO只对少数几种抗生素(阿米卡星、庆大霉素、复方新诺明)耐药率较低。同源性分析结果显示,本地区CRECO分7型,未见覆盖本地区的优势型别。结论十堰地区CRECO耐药机制复杂,产酶基因型主要是NDM-5和KPC-2基因,菌株对多种抗生素耐药。未发现本地区的克隆菌株爆发流行。

某医院耐碳青霉烯酶类鲍曼不动杆菌耐药基因研究和同源性分析

目的研究本院耐碳青霉烯酶类鲍曼不动杆菌(CRAB)的耐药基因情况,并通过基因检测分析细菌同源性,为防止院内感染、预防性用药提供依据。方法收集无锡市骨科医院2019年1—11月临床分离的56株CRAB菌株,细菌经过分离培养,采用BD Phoenix100全自动微生物分析鉴定仪进行菌株鉴定和药敏试验,并采用PCR的方法检测鲍曼不动杆菌的碳青霉烯类耐药基因,菌株的同源性分析使用肠杆菌科基因组内重复一致序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)方法。结果56株CRAB菌株中有48株(85.7%)OXA51基因阳性,52株(92.9%)OXA23基因阳性,均未检测到OXA24及OXA58基因,对OXA23和OXA51阳性细菌进行同源性分析,38株(80.0%)属于同一基因谱。所有细菌对18种药物耐药率>95.0%,且对美罗培南,亚胺培南的耐药率均>98.0%。结论无锡市骨科医院CRAB主要为OXA23型、OXA51型菌株,且该类细菌呈多重耐药,提示临床应加强医院感染的管理,防止该类鲍曼不动杆菌的暴发传播。

猕猴肠道菌群基因组DNA提取及其ERIC-PCR分析

本试验采用反复冻融法、酶裂解法和试剂盒法分别提取猕猴肠道菌群的总DNA,根据提取的DNA浓度和纯度最终确定酶裂解法为较好的方法。将酶裂解法提取的DNA进行ERIC-PCR扩增,结果显示:同年龄组猕猴粪样的ERIC条带数量和位置变化不大;幼年组猕猴的菌群种类较丰富,但优势菌群不明显;青年组猕猴的菌群种类和优势菌群最为丰富;老年组猕猴的菌群种类最少。

一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的:基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR),寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法:寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果:根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针(1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’)。结论:根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

长沙地区临床分离碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的分子流行病学特征

目的:了解长沙地区临床分离鲍曼不动杆菌的耐药性,探讨碳青霉烯类抗生素耐药菌株的分子流行病学特征。方法:收集长沙地区10所综合性医院2010年3月至2010年12月间临床分离的非重复鲍曼不动杆菌株205株;采用K-B法检测药物敏感性,改良双纸片协同试验检测金属β-内酰胺酶(金属酶),改良Hodge试验筛查碳青霉烯酶;PCR扩增OXA-23,OXA-24,OXA-51,OXA-58及IMP-1和VIM-2型碳青霉烯酶基因,并进行测序分析。应用肠杆菌科基因间一致重复序列聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR,ERIC-PCR)对菌株进行DNA分型及同源性分析。结果:在监测的18种药物中,耐药率超过50%的达14种。其中哌拉西林耐药率最高(80.5%),头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(2.5%)。共筛选出耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌115株,其金属酶表型及基因检测均为阴性;改良Hodge试验阳性71株,其中64株OXA-23基因扩增阳性。115株菌株OXA-51均阳性,未检出OXA-24,OXA-58基因。115株菌株共分为7个ERIC基因型。其中A型19株,B型72株,为主要的流行克隆。结论:长沙地区临床分离鲍曼不动杆菌多重耐药十分严重;产OXA-23和OXA-51型碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的重要机制,且碳青霉烯类耐药菌株存在克隆流行。

苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究

目的探讨苏云金芽孢杆菌(Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bc)的亲缘关系,为Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供科学依据。方法采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增,对其指纹图谱进行分析;回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段,以其为探针,分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果与蜡状芽孢杆菌相比,苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致;所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250 bp左右的片段;苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌均可扩增产生600 bp左右的共有DNA片段。此外,以苏云金芽孢杆菌500 bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系;500 bp片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。

大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响

应用肠杆菌基因间重复共有序列基因扩增(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)和聚合酶链式反应--变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)研究大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响。灌胃红星二锅头建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,ERIC-PCR和PCR-DGGE电泳获得肠道菌群指纹图谱,分析肠道菌群的相似性和多样性并鉴定优势条带序列。ERIC-PCR结果表明急性酒精性肝损伤模型小鼠肠道菌群结构发生明显改变,以360 bp的条带为优势条带,610 bp左右的条带强度减弱,大蒜多糖预防给药组中360 bp左右的条带强度减弱。PCR-DGGE结果显示急性酒精性肝损伤的小鼠肠道菌群多样性指数降低,优杆菌属和乳酸菌属细菌明显减少。大蒜多糖高剂量组的多样性指数和均匀度指数最高,优杆菌属和乳酸菌属细菌增多。大蒜多糖可以促进肠道中优杆菌属和乳酸菌属生长,调节急性酒精性肝损伤伴有的肠道菌群失调。

副溶血性弧菌ERIC-PCR分型及毒力基因检测研究

目的:建立副溶血性弧菌ERIC-PCR分子分型技术,分析副溶血性弧菌标准菌株及分离株基因组DNAERIC-PCR指纹图谱,并对副溶血性弧菌毒力基因进行检测,以了解不同来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况。方法:提取副溶血性弧菌基因组DNA,以肠杆菌基因间共有重复序列(ERIC)为引物进行PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析,并以相似性系数构建聚类图;通过PCR方法对直接耐热溶血素(TDH)和耐热直接相关溶血素(TRH)进行检测。结果:26株副溶血性弧菌均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,ERIC-PCR可将26株菌分为12个型,分辨力指数为0.926;只在临床分离株中检测到TDH基因,而除一株标准菌株外,所有菌株都未检测到TRH基因。结论:研究显示ERIC-PCR可从分子水平对副溶血性弧菌基因组DNA进行快速指纹图谱分析,同时结合毒力基因检测,能够为副溶血性弧菌食物中毒疾病的预防和流行病学调查提供科学依据。