肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立

由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。

泉州市某区食品中致泻性大肠埃希菌的检测情况

目的 分析泉州市某区集贸摊点和超市食品中致泻性大肠埃希菌携带情况。方法 选择2021年1—12月从泉州市鲤城区超市以及集贸摊点采集的100份食品样本作为研究对象,严格按照GB 4789—2016《食品安全国家标准食品微生物检验致泻性大肠埃希菌检验》对所有标本开展致泻性大肠埃希菌微生物检验以及毒力基因检测,统计最终的检测结果。比较不同食品类型的致泻性大肠埃希菌检出率差异。结果 100份检测样本当中,总共20份检出致泻性大肠埃希菌,检出率为20.00%;其中包含产肠毒性大肠埃希菌(entero toxigenic Escherichia coli,ETEC)共6株,占比为30.00%;肠致病性大肠埃希菌(entero pathogenic Escherichia coli,EPEC)共5株,占比为25.00%;肠出血性大肠埃希菌(entero hemorrhagic Escherichia coli,EHEC)共5株,占比为25.00%;肠侵袭性大肠埃希菌(entero invasive Escherichia coli,EIEC)共4株,占比为20.00%。牲畜肉类、生禽肉类、凉拌类、海产类以及蔬菜类食品的致泻性大肠埃希菌检出率依次为38.89%、45.00%、5.00%、10.00%、4.55%,其中牲畜肉类、生禽肉类的致泻性大肠埃希菌检出率高于其他食品类型(P <0.05)。分离获得的致泻性大肠埃希菌20株内,出现EHEC的O157共5株;血清凝集予以H7鉴定,其中共有5株EHEC的O157:H7鉴定血清凝集,1株O157在羊肉上分离获得,SLT2、hly、eaeA毒力基因均在H7菌中携带,其他O157共4株,4种毒力基因均为阴性。结论 严格按照有关标准开展微生物检验能有效检出食品中的大肠埃希菌以及致泻性大肠埃希菌毒力基因,有关部门应该要加强卫生监督的力度,确保人民群众的食品安全。

2014～2018年北京市人源性肠产毒性大肠埃希菌耐药性与PFGE分子分型研究

目的分析北京市门诊腹泻病例肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC)分离株抗生素敏感性及分子分型特征。方法采用微量肉汤稀释法对2014~2018年北京市门诊腹泻病例ETEC分离株进行8大类14种抗生素敏感性检测。参照PulseNet中非O157大肠埃希菌脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型方法,对不同区县不同采样时间分离的菌株采用随机抽样原则,对178株菌基因组经限制性内切酶Xba I酶切后进行分子分型和聚类分析。结果 578株2014~2018年北京市门诊腹泻病例ETEC菌株总耐药率为94.29%,对萘啶酸、氨苄西林、头孢唑林耐药率较高,分别为61.58%、60.38%、36.19%。578株菌分为152个耐药谱,耐3种及3种以上抗生素的菌株数达340株(59.00%),有1株菌对12种抗生素耐药。常见耐药谱为耐喹诺酮类的萘啶酸,占20.18%,其次为耐β-内酰胺类的氨苄西林-头孢唑林-头孢噻肟,占12.29%,再次为耐β-内酰胺类的氨苄西林-喹诺酮类的萘啶酸-大环内酯类的阿奇霉素,占6.79%,且耐药谱种类逐年缓慢上升。其中178株菌共产生153种PFGE带型,带型分布较为分散,无优势带型,菌株之间的相似系数为31.60%~100.0%。结论 2014~2018年北京市腹泻病例肠产毒性大肠埃希菌耐药情况严重,耐药谱复杂广泛,多重耐药菌株占比呈逐年缓慢上升趋势。PFGE带型呈多态性分布。

一起由肠产毒性大肠埃希菌引起的食物中毒调查报告

2007年7月25日下午，广西百色市右江区大楞乡某村屯发生一起细菌性食物中毒。经调查，确认为一起由肠产毒性大肠埃希菌引起的食物中毒。现报告如下。

东莞口岸首次检出肠产毒性大肠埃希菌O6

目的:检测进口水产品中是否污染致泻性大肠埃希菌。方法:按照GB/T4789.6-2003致泻性大肠埃希菌检验进行。结果:从进口冻贝肉中检出肠产毒性大肠埃希菌O6,并对该菌的形态及生化等特性进行研究。结论:东莞口岸首次检出该菌,该批冻贝肉被彻底销毁,消除了疫病隐患,确保了卫生安全。

重组B亚单位/菌体霍乱疫苗预防儿童产毒性大肠埃希菌感染性腹泻的双盲随机对照研究

目的探讨重组B亚单位/菌体霍乱疫苗(商品名可唯适疫苗)对儿童产毒性大肠埃希菌(ETEC)感染性腹泻的预防效果。方法采用随机、双盲、对照的方法,选择2011年3月—2012年9月深圳市上梅林社区2～12周岁符合ETEC感染性腹泻诊断标准的儿童108例,分为疫苗组与对照组(每组54例),在双盲背景下口服可唯适疫苗或安慰剂(LB培养基干粉胶囊),随访观察12个月。服苗前和全程服苗后2周取空腹静脉血进行血常规、肾功能检查;服苗前和首次服苗后2、6、12个月留取血液及全程服苗后1、2、4周留取粪便进行抗霍乱毒素(抗-CT)、抗霍乱弧菌脂多糖(抗-LPS)及杀弧菌抗体(Vab)测定。结果疫苗组儿童全程服苗后ETEC感染性腹泻发生率为3.7%(2/54),低于对照组的13.0%(7/54),差异有统计学意义(P<0.001);疫苗组儿童全程服苗后12个月内ETEC感染性腹泻次数平均为(0.9±0.5)次,少于对照组的(5.2±0.8)次,差异有统计学意义(t=2.936,P<0.05)。血清抗体:首次服苗后2、6、12个月疫苗组3种抗体阳转率均较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。粪便抗体:全程服苗后1、2、4周两组抗体阳转率间差异有统计学意义(P<0.05)。血清抗体几何平均滴度(GMT):首次服苗后2、6、12个月两组3种血清抗体GMT间差异有统计学意义(P<0.05),且疫苗组首次服苗后6个月高于首次服苗后2、12个月(P<0.05)。粪便抗体GMT:全程服苗后1、2、4周两组粪便抗体GMT比较,差异有统计学意义(P<0.05)。全程服苗后两组儿童血常规与肾功能比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。研究过程中疫苗组出现发热2例,呕吐1例,腹痛1例;对照组出现发热3例;程度较轻,均不需特殊处理。结论可唯适疫苗对儿童ETEC感染性腹泻的预防效果安全而明显,值得在社区推广应用。

基于Web of Science肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)研究领域文献可视化分析

基于Web of Sience数据库,以核心文集内收录的1998—2017年的ETEC文献为数据源,以引文可视化软件HistCite与应用知识图谱工具CiteSpace为工具分析了该领域内影响力较大的国家/地区、研究机构、期刊、作者与研究热点等信息.研究结果表明,ETEC研究领域内影响力最大的国家为美国与瑞典,影响力最大的研究机构是瑞典的哥德堡大学,全球论文被引用数量排名前10的作者有5位来自于哥德堡大学.近20年来,ETEC的相关研究主要集中在其对仔猪的影响、腹泻疾病及产生的肠毒素等几个方面.中国在ETEC相关研究领域内科研实力及影响力相对低,需要加强与优秀科研机构的交流与合作,努力提高自身研究水平和论文质量.

产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展

简述了产肠毒性大肠埃希氏菌(ETEC)K88-K99、K88ac-LTB、K99-F41和ST-LT双价基因工程疫苗的研制方法、生产工艺、免疫效果及生态效应及其研究进展,同时阐明了用这些疫苗免疫妊娠母畜,可使吸吮了母畜初乳的幼畜的腹泻发病率和死亡率显著下降,且不会带来生态环境污染。认为这些基因工程疫苗仍有不足之处,需要进一步加以改进。

重组B亚单位/灭活菌体霍乱疫苗预防肠产毒性大肠埃希菌感染性腹泻专家共识

肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)感染后表现为水样腹泻,严重者可致脱水、电解质失衡并导致死亡。重组B亚单位/灭活菌体霍乱(rBS/WC)疫苗是预防ETEC感染性腹泻的有效手段。国家儿童健康与疾病临床医学研究中心(浙江大学医学院附属儿童医院)和浙江省疾病预防控制中心组织国内临床医学、预防医学领域的专家参考有关病原学、流行病学、疫苗效果、安全性,以及卫生经济学等方面最新循证证据,制订了rBS/WC疫苗预防ETEC感染性腹泻的专家共识,指导临床医师和预防接种专业人员科学、规范接种疫苗,降低ETEC感染性腹泻的发病率。

肠产毒性大肠埃希菌定植因子研究进展

肠产毒性大肠埃希菌定植因子为近几年发现的一种重要的细菌致病菌毛,它能使大肠杆菌粘附于宿主肠牯膜而不被肠蠕动和肠分泌液所清除,再通过其分泌肠毒素导致婴幼儿和旅行者腹泻。菌毛亚单位的保守区域、抗原决定簇组成、定植因子质粒与毒力编码基因的联系,对研制广谱重组菌毛疫苗具有重要指导意义。本文综述了近几年来有关定植因子菌毛的研究进展,以及与各类肠毒素编码质粒的相关性和疫苗研究概况。

上海地区首次发现和阿奇霉素耐药高度相关的肠产毒性大肠埃希菌O∶6血清群的流行克隆

目的 基于监测网络对肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)成年人腹泻病例开展分子特征研究,探索流行病学对实验室技术和数据需求的实践模式.方法 以ETEC腹泻流行季节的成年人病例为对象进行流行病学设计和抽样,鉴定肠毒素型、血清群、耐药表型、定殖因子及分子型,通过多维度与多变量数据展示获得ETEC多个动态表型特征.结果 2016-2018年监测网络符合条件的ETEC病例84株.优势血清/毒素型依次为O:6(STh)、O:25(LT)、O:159(STh)、O:153 (STh),O:6(STh+CS21)取代O∶ 25和O∶ 159成为2018年的流行克隆,2017年的6例O:153(STh+CFA/I+CS8+PT34)为输入型暴发案例;成年人ETEC耐药率超过30%有磺胺异恶唑、萘啶酸、氨苄青霉素和阿奇霉素,多重耐药菌(MDR)达58.3%,血清/毒素型别提示弱毒株易形成MDR;分子分型证实O∶6血清群优势克隆(PT20~24)的遗传相似度超过O:25和O∶ 159,且与阿奇霉素最低抑菌浓度(MIC)和耐药基因mphA间存在高度相关性(87.5%,28/32),O∶6(STh+CS21 +mphA)耐药克隆始于2016年.结论 上海地区ETEC成年人腹泻病例新的流行克隆为O:6(STh+CS21+mphA),首次观察到阿奇霉素耐药基因mphA和ETEC某个血清群存在关联.基于流行病学构建的多维度和多变量分析技术,有助揭示ETEC潜在传播规律,达到精准监测和预警暴发目的.

肠产毒性大肠埃希菌F4ac菌毛蛋白FaeG亚单位的原核表达及免疫学鉴定

目的克隆并表达肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG,为制备预防幼畜ETEC感染的疫苗奠定基础。方法以ETEC(C83902)基因组DNA为模板,PCR扩增faeG基因,插入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-faeG。将pGEX-faeG转化大肠埃希菌BL-21I,PTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Western blot鉴定其抗原性。将表达菌超声破碎后离心提取包涵体制备抗原,经口灌喂免疫小鼠,检测小鼠血清中抗FaeG的IgGI、gA,鉴定其免疫原性。结果扩增的faeG基因全长786 bp,与基因文库中的faeG基因同源性达96%。重组质粒pGEX-faeG经PCR及双酶切鉴定确有插入片段,且序列完整。表达产物FaeG相对分子质量约53 kD,主要存在于碎菌后的沉淀中,以包涵体形式表达。Western blot显示该蛋白可与ETEC F4ac阳性血清特异性结合,免疫后小鼠血清抗FaeG IgGI、gA明显高于PBS和GST对照组。结论成功构建了ETEC F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG的重组质粒pGEX-faeG,表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制预防幼畜ETEC感染的疫苗。

一起由肠产毒性大肠埃希菌引起食物中毒的调查报告

目的查明衡东县某企业早餐发生的一起食物中毒原因。方法 开展流行病学和现场卫生学调查,采集可疑食物、病人粪便、餐厅从业人员的肛拭子进行相关检验。结果从可疑食物(米粉)、病人粪便中分离出肠产毒性大肠埃希菌3株,经鉴定血清型均为O6:K15。结论该起食物中毒由肠产毒性大肠埃希菌引起,因进食被肠产毒性大肠埃希菌污染的米粉所致。

上海市2012-2013年4种致泻性大肠埃希菌监测

目的 基于临床医院开展4种致泻性大肠埃希菌（DEC）人群监测,探讨公共卫生实验室对临床实验室需求的直接技术指导的实践模式.方法 设立哨点医院,以标准化方法筛选和鉴定DEC菌型;构建DEC流行特征基线;对疑似暴发病例开展基于实验室和流行病学调查.结果 2012-2013年选择上海地区4家哨点医院检测7 204份腹泻标本确认的712例DEC感染病例,阳性率为9.9％.其中肠致病性大肠埃希菌（EPEC）感染351例;肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）感染292例;肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）感染32例;产志贺样毒素大肠埃希菌（STEC/EHEC）感染6例;DEC混合感染31例.EPEC感染以1～5岁儿童最多见,菌型均为aEPEC;ETEC流行峰值在8月,阳性率＞20％,感染病例2012年聚集于1 ～ 28日龄和2013年的20 ～ 60岁人群（P＜0.05）,菌型以耐热肠毒素（ST）型最多（59.6％）,其次为不耐热肠毒素（LT）型（27.8％）和ST/LT型（12.6％）;2013年儿童感染EIEC病例明显增加（P＜0.01）;未监测到EHEC O157：H7,但确认2例EHEC O26：H11（eae-hlyA-stx1a）儿童病例;调查确认2012年上海地区15例新生儿ETEC聚集性感染病例与四川省自贡市新生儿病例属于同一克隆（STh-CS21-CFA/I-ClyA-EatA-ST2332-SHNL0005）.结论 上海地区DEC型谱特征已发生改变,ETEC对新生儿院内感染和食源性感染性腹泻构成潜在暴发风险,需加强实验室主动监测.

上海市普陀区2012年-2016年4种致泻性大肠埃希菌的监测分析

目的分析上海市普陀区2012年-2016年腹泻人群中4种致泻性大肠埃希菌(EPEC、ETEC、EIEC、EHEC)感染及分布情况,为致泻性大肠埃希菌病的监测、暴发预警提供基线与参考数据。方法设立哨点医院,以标准化方法筛选和鉴定DEC的毒力因子、菌型和耐药特征;构建DEC流行特征基线。结果 2012年-2016年,2家哨点医院检测2 988份腹泻标本确认DEC病例共334例,阳性率为11.2%,其中EPEC 169例(5.7%)、ETEC 148例(5.0%)、EIEC 3例(0.1%)、STEC/EHEC 3例(0.1%)、MDEC 11例(0.4%)。成人腹泻监测点优势病例为ETEC感染,流行呈明显的季节特征,峰值多在每年8月;儿童腹泻监测点优势病例为EPEC感染,感染峰值每年均在6月,男、女性别比为37∶20,男性明显高于女性。DEC药敏试验中耐药率最高的药物为萘啶酸(NA)(39.6%),其次为四环素(TE)(38.0%)和复方新诺明(SXT)(25.5%)。结论上海市普陀区DEC型谱特征已发生变化。ETEC夏季食源性感染风险大,需要加强公共卫生实验室主动监测能力。

中草药有效成分酶解法提取工艺优化及其不同配方对引起仔猪腹泻细菌的抑制作用

【目的】探明中草药有效活性成分的提取条件,并筛选抑制仔猪腹泻细菌的高效中药方剂,为生猪养殖过程中绿色防治断奶仔猪腹泻提供理论依据。【方法】采用酶解法提取中草药的有效成分,通过单因素试验研究有效成分提取的温度、时间、pH、酶用量、料液比和处理方式对提取效果的影响,从而确定酶解的最佳条件;利用抑菌圈法测定不同中草药对肠产毒性大肠埃希氏菌、猪霍乱沙门氏菌和绿脓杆菌的抑菌情况,筛选具有较好抑菌效果的中药方剂。【结果】酶解法提取中草药有效成分的最佳工艺为提取温度55℃+提取时间2 h+酶添加量为3%+料液比为1∶25,pH 10,提取前对中草药进行研磨处理。肠产毒性大肠埃希氏菌对单味中草药连翘表现极敏〔抑菌圈直径(Φ)22.2 mm〕,对石榴皮(Φ15.7 mm)和山楂(Φ19.4 mm)表现高敏,优化配方为山楂+虎杖+石榴皮+苦参(Φ18.4 mm);猪霍乱沙门氏菌对单味中草药黄芪(Φ19.2 mm)和川黄柏(Φ15.5 mm)表现高敏,优化配方为黄芪+川黄柏+石榴皮(Φ24.4 mm);绿脓杆菌对单味中草药板蓝根(Φ11.5 mm)和党参(Φ12.1 mm)表现高敏,优化配方为党参+鱼腥草+甘草+龙胆草(Φ15.0 mm)。【结论】中药方剂山楂+虎杖+石榴皮+苦参、黄芪+川黄柏+石榴皮和党参+鱼腥草+甘草+龙胆草分别对引起仔猪腹泻的肠产毒性大肠埃希氏菌、猪霍乱沙门氏菌和绿脓杆菌具有高效抑制作用。

3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立

目的:建立快速检测食源性致病菌的多重PCR方法。方法:本研究根据肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)的大肠杆菌不耐热毒素(Heat labileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)的侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),分别设计了三对引物,预计PCR扩增的目的基因片段为194、279和435 bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测肠毒性大肠埃希菌、伤寒沙门菌和福氏志贺菌的稳定的单管多重PCR方法。结果:该方法检测的灵敏度分别为:145 pg/ml肠毒性大肠埃希菌的基因组DNA、100 ng/ml伤寒沙门菌的基因组DNA、7 ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA,与单基因PCR检测的灵敏度相同。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。结论:该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控。

一起细菌性食物中毒的实验室检测结果分析

目的了解2007年8月15日经由怀化站的六趟旅客列车上发生食物中毒的原因。方法进行流行病学和现场卫生学调查,采集可疑食品、病人呕吐物、重点食品从业人员(售货员)的血液及肛拭子进行相关检验。结果从可疑食物(卤鸡腿)、病人呕吐物、可疑暴露来源(腹泻售货员易某肛拭子)分离出同一种大肠埃希菌,经鉴定为ETEC:O153。结论此次事件为肠产毒性大肠埃希菌所致食物中毒,卫生监督管理部门应加强宣传和监管力度,以防食物中毒事件再次发生。

食源性致病菌考核样品定性分析

目的:对国家食品安全风险评估中心发放的2012年食品安全风险监测的奶粉考核样品根据其要求进行奶粉中食源性致病菌定性分析。方法:参照中华人民共和国国家标准GB/T4789《食品卫生微生物学检验》、GB4789《食品微生物学检验》对考核样品进行食源性致病菌检测。结果:根据镜检、生化、血清、肠毒素试验数据,检出金黄色葡萄球菌、肠产毒性大肠埃希氏菌。结论:通过参加奶粉中食源性致病菌定性检测的质控考核,不仅提高了对食源性致病菌的分离鉴定能力,也提高了实际工作中处理各种样品的能力,从而更好地应对食物中毒、疫情等突发公共卫生事件。