富马酸与肉桂醛联用调节产肠毒素型大肠杆菌诱导猪肠上皮细胞氧化应激的分子机制

本试验旨在研究富马酸(FA)与肉桂醛(CA)联用调节产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)K88诱导猪肠上皮细胞IPEC⁃J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC⁃J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC⁃J2细胞12和24 h,并用CCK⁃8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF⁃κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明:1)FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2)添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降(P<0.05),6、12和24 h时极显著下降(P<0.01)。3)添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)含量(P<0.01),极显著提高抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL⁃10)和转化生长因子-β(TGF⁃β)含量(P<0.01)。4)ETEC K88通过激活NF⁃κB信号通路诱导IPEC⁃J2细胞氧化损伤,添加FA和CA可上调Hsp70 mRNA相对表达量并抑制NF⁃κB信号通路缓解IPEC⁃J2细胞氧化应激。5)添加FA和CA可显著提高ETEC K88感染细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性(P<0.05),极显著降低丙二醛(MDA)含量(P<0.01)。综上所述,FA与CA联用可调节炎性细胞因子和氧化应激蛋白平衡并抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,其可能是通过上调Hsp70抑制NF⁃κB信号通路,增强IPEC⁃J2细胞的抗氧化和抗炎能力,从而缓解ETEC K88诱导的IPEC⁃J2细胞氧化应激。

牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出一株肠毒素型大肠杆菌并对其某些生物学特性进行了研究。结果表明 ,该菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致。血清学试验表明 ,该菌株O抗原属O14 8,K88、K99、987P单因子血清均不能凝集本菌 ;该菌不产生溶血素 ;对绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞表现强凝集 ,而K88、K99、987P抗血清均不能抑制其它对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集 ;该菌株在营养肉汤中经 37℃ ,4 8小时培养表达菌毛 ;肌肉接种兔、腹腔接种小鼠均具有高致病性 ;乳鼠胃内投服试验和兔回肠结扎试验证明 ,该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素 ;分离菌株对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素等高度敏感 ,而对链霉素、四环素。

牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出 1株肠毒素型大肠杆菌并对其某些生物学特性进行了研究。结果表明 ,该菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致。血清学试验表明 ,该菌株O抗原属O14 8,K88,K99,987P单因子血清均不能凝集本菌 ;该菌不产生溶血素 ;对绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞表现强凝集 ,而K88,K99,987P抗血清均不能抑制其对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集 ;该菌株在营养肉汤中经 37℃ ,4 8h培养表达菌毛 ;肌肉接种兔、腹腔接种小白鼠均具有高致病性 ;乳鼠胃内投服试验和兔回肠结扎试验证明 ,该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素 ;分离菌株对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素等高度敏感 ,而对链霉素、四环素、土霉素等表现耐药性。

一株不表达K88、K99、987P粘附因子牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出一株肠毒素型大肠杆菌。该菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致。血清学试验表明 ,该菌的O抗原属O148,K88、K99、987P单因子血清均不能凝集本菌。在MSHA反应中 ,本菌能凝集绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞 ,而K88、K99、987P抗血清均不能抑制其对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集。腹腔接种对小白鼠具有高致病性。乳鼠胃内投服试验和兔回肠结扎试验证明 ,该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素。总之 ,该菌是一株不表达K88、K99、987P的、能产生ST和LT的肠毒素型大肠杆菌。

肠毒素型大肠杆菌F18菌毛对产蛋鸡免疫的原性

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株F18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,F18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效价最高可达1∶25600,血清抗体效价高于卵黄抗体效价,最高可达1∶51200.

对FC株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究

FC菌株是一株从腹泻仔猪粪便中分离的肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)。在MRHA反应中,本菌能凝集人O型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,对人O型和豚鼠红细胞有很高的血凝性,血抗K88和K99血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血凝。在体外小肠上皮细胞吸附试验中,本菌对仔猪小肠上皮细胞具有强烈的吸附作用;透射电镜和扫描电镜观察证实了FC株菌除表面具有一种纤毛样结构外,还能定居在仔猪小肠段。血清学试验结果表明,本菌的O抗原属于O101。K88和987P两种抗血清均不能凝集本菌,而K99和F41抗血清均可凝集。对纯化的FC株菌粘着素抗原作等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果表明,该菌的粘着素是由等电点分别为4.61和9.78,分子量分别为29500和17500的两种蛋白质抗原所组成。此外,用乳鼠胃内投服试验和兔肠结扎试验证明,该菌只产生热稳定肠毒素。总之,本菌是一株能产生ST的K99,F41的肠毒素型大肠杆菌。

产肠毒素型脆弱拟杆菌促进结直肠癌发生发展的机制研究进展

脆弱拟杆菌是人体肠道常见的革兰阴性专性厌氧菌。根据能否合成分泌脆弱拟杆菌肠毒素,其可分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(ETBF)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌。ETBF是结直肠相关性疾病中检出率最高的厌氧菌,但由于分离、培养和检测均相对困难,有关ETBF的研究仍较少。随着宏基因组学的兴起,肠道菌群成为研究热点,ETBF的生物学特性和功能得到进一步阐明,其可能对结直肠癌(CRC)的发生发展有积极促进作用,如诱导慢性炎症的发生,激活Wnt/β联蛋白通路促进结直肠细胞的增殖等。因此,探讨ETBF的生物学功能及其在CRC中的作用机制对CRC的筛查和预防尤为重要,未来应对ETBF在CRC病变早期的丰度变化、功能作用以及具体调控机制进行深入研究。

植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制

本试验旨在研究植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制。试验利用植物乳杆菌预处理猪肠上皮细胞IPEC⁃J23 h,ETEC刺激细胞1、3、6、12和24 h,收集细胞及其培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液中白细胞介素-1β(IL⁃1β)、白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)的含量,采用实时荧光定量PCR检测细胞中Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)以及NOD样受体3(NLRP3)和NOD样受体6(NLRP6)的表达,采用Western blot检测细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[p38和细胞外信号调节激酶(ERK)]和核转录因子-κB(NF⁃κB)p65的磷酸化水平以及紧密连接蛋白———闭合小环蛋白-1(zonula occludens⁃1,ZO⁃1)和闭锁蛋白(occludin)的表达。分别采用p38 MAPK抑制剂、ERK⁃MAPK抑制剂和NF⁃κB p65抑制剂处理IPEC⁃J2细胞1 h,再用植物乳杆菌预处理细胞3 h,最后用ETEC处理细胞24 h,收集细胞和培养上清,采用ELISA法检测IL⁃1β、IL⁃8和TNF⁃α含量以及乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果表明:1)与ETEC处理相比,植物乳杆菌预处理能够极显著降低ETEC感染12~24 h细胞产生IL⁃1β、IL⁃8和TNF⁃α的含量(P<0.01),显著或极显著提高ETEC感染3~12 h细胞中TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6的mRNA相对表达量(P<0.05或P<0.01),极显著降低ETEC感染24 h细胞中TLR2和NLRP3的mRNA相对表达量(P<0.01),极显著降低ETEC感染3~6 h细胞中p38 MAPK和NF⁃κB p65的磷酸化水平(P<0.01),显著或极显著提高ETEC感染6~24 h细胞中ZO⁃1和occludin的表达量(P<0.05或P<0.01)。2)与ETEC处理相比,抑制剂和植物乳杆菌共同作用能够极显著降低ETEC感染细胞产生IL⁃1β、IL⁃8、TNF⁃α的含量和LDH的活性(P<0.01),植物乳杆菌单独作用也可以极显著降低ETEC感染细胞产生LDH的活性(P<0.01),并且信号通路抑制剂对植物乳杆菌调控部分促炎性细胞因子的产生有协同作用。综上所述,植物乳杆菌可以通过致弱p38 MAPK磷酸化和阻断NF⁃κB信号通路的活化而降低炎症相关因子的产生,从而表现出提高猪肠上皮细胞完整性的潜力。

貉产肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

致病性大肠杆菌能产生一种或多种肠毒素,称为毒素型大肠杆菌(ETEC)。ETEC是导致人畜腹泻的主要致病菌,借助于所产生的菌毛抗原黏附于动物小肠粘膜定居并产生作用于肠壁的外毒素称为肠毒素。主要有两类肠毒素:一类是不耐热性肠毒素,即热敏感性肠毒素(LT);另一类是耐热性肠毒素,即热稳定性肠毒素(ST)。仔猪的黄、白痢。

产肠毒素型大肠杆菌致死白眉长臂猿的病例分析

1发病情况2014年7月初,德宏州野生动物收容救护中心饲养的4只白眉长臂猿先后出现以腹泻为主的传染病症,自第一例发病开始到最后一例康复,共经历了10d,白眉长臂猿发病率为100%,经过诊治1只死亡,3只痊愈,经对患病白眉长臂猿病症进行分析,发现产肠毒素型大肠杆菌是导致白眉长臂猿死亡的主要原因。在白眉长臂猿发病后,我中心对圈舍进行大规模消毒,中心内其他灵长类未出现类似病症。

产肠毒素型大肠杆菌腹泻小鼠模型中小肠AQP3和AQP4的表达

为探讨产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)小鼠腹泻模型中小肠水通道蛋白表达量的变化,运用Real time PCR和ELISA分别检测了ETEC腹泻小鼠模型中空肠AQP3和回肠AQP4的基因表达量和蛋白质质量浓度。结果显示,小鼠在感染ETEC产生腹泻后,空肠AQP3和回肠AQP4的基因表达量和蛋白质质量浓度均呈时间依赖性下降。结果提示,ETEC引起腹泻的机制可能与其改变了小肠水通道蛋白的表达有关。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素间接竞争ELISA检测方法的建立

以金黄色葡萄球菌B型肠毒素免疫Balb/c小鼠,待血清效价达到要求后,腹腔注射骨髓瘤细胞,制备抗金黄色葡萄球菌B型肠毒素抗体,并建立快速检测金黄色葡萄球菌B型肠毒素的间接竞争ELISA(ciELISA)方法。经方阵滴定确定B型肠毒素的最佳包被浓度为0.31μg/ml,抗B型肠毒素抗体的稀释度为1:1.2×104,羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1:103。本实验建立的B型肠毒素的间接竞争ELISA检测方法的最低检测量为1ng/ml,线性检测范围为1～103ng/ml,相关系数R2=0.9951,人工污染样品的平均回收率为94.5%。

重组葡萄球菌B型肠毒素超抗原的制备及抗肿瘤活性分析

目的 采用基因工程技术制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB) ,并对其体内外抗肿瘤活性进行分析。方法 对SEB在大肠杆菌中进行高效表达和分离纯化 ,并对其超抗原活性和免疫学活性与天然SEB进行比较研究。观察重组SEB对人肝癌细胞的体外抑制作用 ,以及对小鼠肝癌和肉瘤的体内抑瘤效果。结果 SEB获得高效表达 ,并一步将其纯化至均质。与天然毒素相比较 ,重组SEB的免疫学活性与超抗原活性基本相似。首次证明 ,即使SEB的浓度为 10ng/L ,仍然对人肝癌细胞有显著地抑制作用 ,其对小鼠体内的肝癌和肉瘤有一定的抑制作用。结论 重组SEB在体内外均有一定肿瘤抑制作用 。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的培养产毒与柱层析纯化

本文采用玻璃纸覆盖琼脂平板法,在37℃培养金黄色葡萄球菌48h后,收集菌体,10000×g离心15min,上清液经聚乙二醇20000浓缩。浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32层析和葡聚糖凝胶SephadexG-75过滤纯化,获得电泳纯的金黄色葡萄球菌B型肠毒素。实验证明,利用该简化的二步柱层析分离得到的金黄色葡萄球菌B型肠毒素完全能满足血清学检实验和鉴定的要求,方法简便易行,一般实验室均可使用。

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的 :探讨金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法 :将金葡菌诱导成稳定L型后 ,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB) ,用PCR法检测SEB基因。结果 :金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ,PCR发现 4 78bp的阳性条带。结论 :金葡菌变异为L型后SEB产生量不变 ,其基因也未丢失。

多重PCR方法快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型

针对金黄色葡萄球菌肠毒素基因A,B,C,D(SEA,SEB,SEC,SED)设计了特异性引物,并以其耐热核酸酶nuc基因作为阳性对照,运用多重PCR方法建立金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的快速检测方法,通过优化多重PCR反应体系及条件,得到最优组合。结果表明,该方法特异性好、检测效率高、能够同时对4种肠毒素进行分型,其中SEA,SEB,SEC,SED的检测灵敏度达到0.072,0.072,0.2268,0.198 g/L,适合运用于牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素的快速检测。

产A型肠毒素金黄色葡萄球菌的筛选及其重组表达

目的分离产A型肠毒素金黄色葡萄球菌标准株,克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),研究其生物学特征。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,亚克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达和纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得抗血清,进行重组蛋白免疫原性分析。结果成功克隆SEA全长基因,经DNA序列分析证实与GenBank收录序列具有100%的同源性。表达蛋白相对分子质量为31000,以包涵体形式存在。纯化、复性后获得有活性的rSEA蛋白,rSEA蛋白能够识别天然的SEA。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,rSEA具备抗原性,为制备单抗、诊断试剂及金黄色葡萄球菌致病机制研究奠定了基础。