金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的调查分析

目的检测临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况与SA耐药的关系。方法采用聚合酶链反应检测SA mecA基因和肠毒素基因,了解肠毒素基因在SA中分布的状况,并对其进行耐药性分析。结果 67株甲氧西林耐药的SA(MRSA)和57株甲氧西林敏感的SA(MSSA)肠毒素基因携带率(100%vs 83.5%)无明显差异(χ2=0.203,P>0.05)。肠毒素基因检出率为93.5%(116株),其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株(67.2%),以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+SEF基因为主,检出率分别为33.6%、7.8%和13.8%。与携带一种肠毒素基因的菌株耐药率相比,携带多种肠毒素基因的菌株耐药率呈上升趋势,其中携带SEA+SEC+SEF的菌株对复方新诺明的耐药率为75.0%,高于单独携带SEA(28.6%)、SEA+SEC(38.7%)的耐药率,具有统计学差异(P<0.05)。携带SEA+SEC+SEF、SEA+SEF、SEA的菌株对阿米卡星耐药率分别为75.0%、77.0%和21.5%,前两者与携带SEA的菌株相比有显著差异(P<0.05)。结论临床分离的SA中携带多种肠毒素基因的菌株在耐药率上高于只携带一种肠毒素基因的菌株,提示肠毒素在SA耐药中起重要作用。

6种食品防腐剂对金黄色葡萄球菌抑菌效果及肠毒素基因表达的影响

目的:探索6种食品防腐剂——亚硝酸盐、苯甲酸钠、ε-聚赖氨酸、壳聚糖、茶多酚、Nisin对1株引起食物中毒的金黄色葡萄球菌SA003的抑菌作用,以及对该菌株所含不同肠毒素基因在m RNA水平表达的影响。方法:按照GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》限量标准的质量浓度,分别添加6种不同的防腐剂在金黄色葡萄球菌SA003初始接菌量约为105 CFU/m L的TSB液体培养基中,37℃培养24 h后进行菌落计数;同时收集菌体用于RNA提取,将提取的RNA进行反转录后,采用荧光定量聚合酶链式反应方法检测各肠毒素基因在m RNA水平上的相对表达量。结果:在国标最大限量条件下,不同添加剂对金黄色葡萄球菌SA003的抑菌作用强弱顺序分别为:Nisin>茶多酚>壳聚糖>ε-聚赖氨酸>苯甲酸钠>亚硝酸盐。6种防腐剂均能抑制肠毒素sea、sed、seg、sei、selj、selm、selr和selu基因在转录水平上的表达,但作用效果存在差异。结论:在TSB液体培养基中添加一定剂量的防腐剂不仅能抑制金黄色葡萄球菌的生长,还能够显著降低肠毒素基因的表达量。

霍乱弧菌几种肠毒素基因的检测研究

目的 了解我省分离的霍乱弧菌中几种主要肠毒素基因的携带情况。方法 以地高辛标记基因探针 ,对我省历年分离的 91株霍乱弧菌 (包括EVC和VCO13 9)作霍乱肠毒素基因探针杂交检测。结果 EVC流行株和VCO13 9菌株中 ,普遍存在ctxAB、Zot、Ace等毒素基因 ,该 3种基因的携带率分别达到10 0 %,98 86 %,96 5 9%;而EVC非流行菌株则均不携带上述3种毒素基因。结论 提示EVC流行株和VCO13 9菌株具备较强的产毒能力 ,流行性强 ,应重点加强监测与研究。从ctxAB基因的RFLP杂交图谱分析 ,EVC流行株和VCO13 9在遗传特征上具相近的特点 ,结果均显示 2条阳性杂交带。

金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分型和分布

目的:建立金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测方法。初步研究生牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布状况。方法:应用PCR扩增经分离鉴定的金黄色葡萄球菌肠毒素基因SEA-SEJ,电泳检测扩增结果。结果:建立了金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR检测方法。从生牛奶中分离的29株金黄色葡萄球菌检测到SEA-SED和SEG-SEJ基因,没有检测到SEE基因。毒素基因携带率为65.5%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占37.9%。有SEA基因的占51.7%,含其它传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占17.2%,携带新发现的毒素基因SEG、SEH、SEI和SEJ的菌株占41.4%。结论:建立的PCR检测金黄色葡萄球菌的肠毒素基因的方法可用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型和分布的研究。研究表明,生牛奶中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,而且携带新发现的肠毒素基因的较多。

金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布的研究

为了研究g型肠毒素基因(SEg)i、型肠毒素基因(SEi)在金黄色葡萄球菌菌株中的分布状况,本试验以分离自人化脓组织、生牛乳等8种不同来源的371株金黄色葡萄球菌菌株作为研究对象,利用PCR技术对肠毒素基因的分布进行检测。结果表明:267株金黄色葡萄球菌检出含有肠毒素基因,总检出率为71.97%。其中SEg基因的总检出率为67.93%,SEi基因的总检出率为57.68%。各来源间金黄色葡萄球菌肠毒素的检出率不同,且同一来源的菌株其SEg和SEi的检出率也不同,表明不同来源以及不同肠毒素的基因型在金黄色葡萄球菌中的分布存在差异。

ETEC肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

肠毒素性大肠杆菌的致病性与其具有粘附性的菌毛和产肠毒素的能力密切相关。由于菌毛的血清型多而复杂 ,肠毒素只有不耐热肠毒素 (LT)和耐热肠毒素 (ST)两种 ,因此成为研究的对象。用三对扩增产物分别为 1 1 0bp、2 37bp、368bp的引物建立了检测LT和STⅠ、STⅡ毒素基因的多重PCR方法。扩增产物分别用HindⅢ、HincⅡ、Sau3AⅠ限制性内切酶酶切 ,均得与预期一致的 2个片段。对各个参考株的检测结果为 1 0 0 %符合。结果表明该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性。

沙门菌肠毒素基因克隆及序列分析

研究常见的不同血清型沙门菌肠毒素(stn)基因核苷酸序列之间的差异及其分布情况。根据沙门菌的stn核苷酸序列设计一对引物,应用PCR技术,分别对肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆及序列分析,并用所设计的引物检测7种血清型沙门菌(42株)。结果显示,3种沙门菌经PCR均扩增出749 bp的特异条带,DNA序列分析证实,沙门菌的stn核苷酸序列比较保守,42株沙门菌stn的检出率为100%。本试验成功克隆出沙门菌的stn,调查其在不同血清型沙门菌中的分布及序列分析,为进一步研究stn致病机理及研制减毒沙门菌活菌疫苗奠定了基础。

3种肠毒素基因在苏云金芽孢杆菌中的分布

采用PCR方法对引自美国俄亥俄州立大学芽孢杆菌遗传保存中心(BGSC)的45个苏云金芽孢杆菌(B t)进行了hblA、bceT及entS 3种蜡状芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因的检测.结果表明,hblA、bceT及entS的检出率分别为60%、66.7%和44.7%.这45个准菌株涉及到44个B t亚种,说明Bc肠毒素的基因在B t中是普遍存在的,B t的安全性问题仍需继续关注.

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的检测

目的检测临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况。方法根据Genbank的序列设计合成金黄色葡萄球菌肠毒素基因A-F的引物,采用聚合酶链反应方法对随机收集的124株金黄色葡萄球菌肠毒素基因进行检测,并进行序列分析。结果在124株受检的金黄色葡萄球菌中,116株检出肠毒素基因,检出率为93.5%,其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为84.7%、6.5%、61.3%、4.8%和24.2%,未检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株(67.2%),以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+SEF基因为主,检出率分别为33.6%、7.8%和13.8%。序列分析显示所检出的肠毒素基因与Genbank上登陆的参考序列的同源性为97%～100%。结论金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因携带率高,其中以携带SEA、SEC、SEF基因为主。

应用PCR技术扩增大肠杆菌热敏肠毒素基因

以一对合成的特异性寡核苷酸片段为引物，通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），对不同血清型的ＥＴＥＣ以及１０４份牛、猪及鸡源大肠杆菌分离物中ＬＴ基因片段进行扩增。３株已知血清型ＥＴＥＣ、１３份牛源、６份鸡源、１０份猪源的大肠杆菌扩增后可见一条３１４ｂｐ的片段，而非ＥＴＥＣ大肠杆菌、沙门氏菌等扩增后未出现这一片段。扩增产物用ＳｍａＩ酶解为１９０ｂｐ和１２４ｂｐ两个片段。印迹杂交表明，３１４ｂｐ扩增片段及ＳｍａＩ酶解的１２４ｂｐ和１９０ｂｐ片段均能与特异的ＬＴＢ基因探针杂交，Ｄｏｔ－印迹杂交与ＰＣＲ对样品的扩增结果相一致。

鸡源金黄色葡萄球菌分离菌株新型肠毒素基因K的检测

金黄色葡萄球菌能够产生多种肠毒素,它们被认为是引起葡萄球菌食物中毒最主要的原因.本文主要针对从鸡源分离的金黄色葡萄球菌菌株肠毒素基因K进行检测.利用金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因引物对30株分离株进行鉴定;采用肠毒素基因K的上下游引物分别对30株分离菌株DNA进行PCR扩增.结果表明30株分离株中含肠毒素基因K的菌株达到17株,检测率占56.7%.通过本研究可以看出鸡源金黄色葡萄球菌分离菌株中肠毒素基因K的分布状况,揭示了新型肠毒素基因K在分离菌株中的高检出率.

南宁市生牛奶金黄色葡萄球菌污染状况及其耐药性和肠毒素基因检测

目的了解南宁市生牛奶中金黄色葡萄球菌的污染状况及其耐药性和肠毒素(SE)基因的分布,防止由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的发生和指导奶场开展危害分析和掌握关键控制点(HACCP)。方法 2006～2007年收集南宁市三大奶场145份生牛奶按全国食源性疾病监测网提供的方法进行检测,采用VITEK32进行药敏试验,用PCR方法检测肠毒素基因并进行分型。结果 145份样本中,检出金黄色葡萄球菌45株,检出率为31.03%。该批菌株对青霉素G、四环素、红霉素、克林霉素的耐药率较高,分别为80.00%、62.22%、48.89%和31.11%;对氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、苯唑西林、复方新诺明的耐药率相同,均为8.89%;对庆大霉素的耐药率为6.67%;对左旋氧氟沙星、力奈唑烷、莫西沙星、呋喃妥因、万古霉素、利福平为敏感或中度敏感;四重以上耐药菌株有17株,达37.78%;能产生β-内酰胺酶的菌株有36株,阳性率为80%。有3株菌携带肠毒素基因,携带率为6.67%;其中一株菌同时携带2种肠毒素基因,所携带肠毒素基因为SEG和SEI。结论生牛奶中金黄色葡萄球菌污染程度较高,耐药和多重耐药情况比较严重,但肠毒素基因携带率较低,且都是新型肠毒素基因,提示今后应加强对其耐药性和新型肠毒素基因的研究。

2010~2011年四川省部分地区牛乳生产链金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因的分布

2010~2011年间从四川省部分牛乳生产企业采集生产环节（生鲜牛乳-车间半成品牛乳-成品牛乳）牛乳样品893份,用GB 4789.10~2010方法结合科玛嘉显色培养基,从中分离鉴定出191株金黄色葡萄球菌,样品总检出率为21.4%（191/893）,其中生鲜牛乳检出率（26.4%）高,生产车间半成品牛乳（7.1%）次之,成品牛乳未检测出。利用多重PCR方法对部分金黄色葡萄球菌分离株的肠毒素基因（SEA、SEB、SEC、SED）进行检测。结果显示,22.3%（27/121）菌株携带肠毒素基因,7.4%的菌株携带两种及两种以上肠毒素基因。其中,生鲜牛乳源、中间过程牛乳源及成品牛乳源菌株肠毒素基因携带率分别为23.9%（27株）、0.0%（0株）及0.0%（0株）;121株金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEC、SED基因的总检出率分别为13.2%（16株）、10.7%（13株）、5.8%（7株）、3.3%（4株）。研究结果对金黄色葡萄球菌毒力机制研究与乳品质量安全控制具有参考意义。

多重PCR方法快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型

针对金黄色葡萄球菌肠毒素基因A,B,C,D(SEA,SEB,SEC,SED)设计了特异性引物,并以其耐热核酸酶nuc基因作为阳性对照,运用多重PCR方法建立金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的快速检测方法,通过优化多重PCR反应体系及条件,得到最优组合。结果表明,该方法特异性好、检测效率高、能够同时对4种肠毒素进行分型,其中SEA,SEB,SEC,SED的检测灵敏度达到0.072,0.072,0.2268,0.198 g/L,适合运用于牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素的快速检测。

应用聚合酶链反应技术克隆猪源大肠杆菌耐热肠毒素基因

以质粒ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增和克隆了猪大肠杆菌耐热毒素基因ＤＮＡ片段；核苷酸序列分析表明。

C型产气荚膜梭菌肠毒素基因的克隆与序列分析

研究参照国外发表的产气荚膜梭菌肠毒素全基因序列设计合成1对特异性引物，采用PCR技术对C型产气荚膜梭菌贵州分离株（CP2株）肠毒素基因进行扩增，将扩增产物连接到pMD18-T载体，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序。结果：获得的基因序列全长960bp，编码319个氨基酸。同源性分析结果表明贵州分离株CP2株与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99．4％99．8％，推导氨基酸同源性为99．1％～99．7％。

猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素基因的融合及表达

用聚合酶链反应扩增出猪源大肠杆菌编码ST前体 (pro ST)和LT的B亚单位 (LTB)成熟多肽的序列 ,再通过套式PCR将pro ST编码序列 3′端和LTB编码序列 5′端融合 ,并置于同一阅读框内 ,得到ST和LTB的融合基因 ,将此序列克隆到pGEM T质粒中 ,序列分析后 ,亚克隆到表达载体pQE30中 ,在大肠杆菌细胞中得到表达 ,表达的融合蛋白同时具有ST和LTB的抗原性 ,且无ST和LT的生物毒性。

生牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测与分布

目的:应用多重聚合酶链反应(PCR),检测生牛奶中16种金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)基因的分布状况。方法:应用多重PCR的方法,对55个生牛奶样本中经分离鉴定的金黄色葡萄球菌菌株进行肠毒素基因SEA-SE lQ扩增,电泳检测扩增结果。利用16S rRNA基因片段在多重PCR中作为内部阳性参照,同时,所有菌株经反向乳胶凝集试验(reverse passive latex agglutination,RPLA)测定传统的肠毒素型SEA-SED。结果:从生牛奶中分离鉴定的金黄色葡萄球菌,含传统的毒素基因类型SEA-SEE,SEG-SEI基因的菌株仅占25.45%,携带新发现的毒素基因SE lJ-SE lQ的菌株占56.36%。毒素基因携带率为56.36%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占25.45%。结论:应用多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因型,具有敏感、快速、特异的特点,同时适用于传统和新型毒素基因。研究表明,生牛奶中分离的金黄色葡萄球菌带毒素基因阳性率高,而且携带新发现的肠毒素基因的亦占多数,应予以重视。

猪大肠杆菌不耐热肠毒素基因的PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)保守序列为靶序列,设计合成了一对可扩增336 bp目的片段的引物,建立了检测ETEC不耐热肠毒素(LT)基因的PCR方法。该方法对987p+、鼠伤寒沙门氏杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和链球菌的检测结果均为阴性。对15株分离自腹泻仔猪的待检菌株进行检测,有3株LT基因阳性。结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查。