产肠毒素脆弱类杆菌聚合酶链反应检测

背景:产肠毒素脆弱类杆菌(ETBF)能导致家畜、儿童和成人腹泻,已引起广泛关注,但国内尚未见相关报道。目的:通过ETBF聚合酶链反应(PCR)检测,调查不同人群粪便标本中ETBF的阳性率。方法:建立ETBFPCR检测,评估其敏感性和特异性,并检测正常对照组和腹泻组的ETBF阳性率。结果:PCR的敏感性为1×104CFU/ml,常见肠道正常菌群和致病菌均为阴性。正常对照组(475例)和腹泻组(498例)的ETBF阳性率分别为3.6%和6.4%(P=0.042)。其中成人对照组和成人腹泻组的阳性率分别为2.3%和5.7%(P=0.047),儿童对照组和儿童腹泻组的阳性率分别为5.1%和7.3%(P=0.33)。结论:ETBFPCR检测具有较好的敏感性和特异性,ETBF可能为腹泻的致病因素之一。

结直肠癌与产肠毒素脆弱类杆菌ETBF感染的相关性

感染介导的炎症反应可促进受感染器官的癌变。产肠毒素脆弱类杆菌(enterotoxigenic bacteroides fragilis,ETBF)感染分泌的脆弱类杆菌毒素(bacteroides fragilis toxin,BFT)可引起家畜和人类的腹泻,亦可无症状地寄居于部分人群中。最新研究表明,ETBF感染与炎性肠病(inflammatorybowel disease,IBD)和结直肠癌(colorectal cancer,CRC)有关。该文将ETBF杆菌的基本结构、生理特性、致病机制、ETBF感染与CRC的关系以及最新研究进展作一综述。

2009—2020年北京市朝阳区113株食源性金黄色葡萄球菌耐甲氧西林和肠毒素/类肠毒素基因携带与分子分型分析

目的了解北京市朝阳区2009—2020年113株食源性金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药、肠毒素/类肠毒素基因携带和分子分型情况。方法采用纸片扩散法进行头孢西丁药物敏感性实验,结合mec A基因扩增鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA);实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,QR-PCR)检测28种金黄色葡萄球菌肠毒素/类肠毒素(staphylococcal enterotoxins/enterotoxin-likes,SEs/SEls)基因;采用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进行分子分型。结果检出7株MRSA(6.19%、7/113);所有菌株至少携带1种肠毒素/类肠毒素基因,最多携带14种,共检出24种肠毒素/类肠毒素基因;经典sea~see肠毒素基因携带率为0%~33.63%。MLST共24型,ST1、ST398、ST7、ST59为优势型;发现ST6656、ST6688、ST6709、ST6745、ST67545个新型别。PFGE共分25型,H型(11/113)、I型(9/113)、J型(29/113)是优势分型,占比43.36%。结论本地区食源性金黄色葡萄球菌MRSA菌株分离率低于临床株;PFGE分型结果中J、H、I 3种优势型占比近半,显示本地区食源性金黄色葡萄球菌优势菌株集中;优势ST型别主要与医院、社区感染和动物相关。新发现5个ST型别;肠毒素/类肠毒素携带与ST型别存在一定关联性;ST1-MSSA-sea-seh-sek-seq-selw-selx是优势株;仅检测5种经典肠毒素不能代表金黄色葡萄球菌引起食物中毒的致病因子,应扩大肠毒素检测范围。

金黄色葡萄球菌肠毒素对小鼠慢性哮喘模型的抗炎作用

目的:用金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)和肠毒素B(SEB)干预幼年小鼠,观察它们对小鼠慢性哮喘气道炎症的影响以及对气道内相关细胞因子水平的调节作用。方法:实验组中BALB/c小鼠在出生后1周开始腹腔注射0.1 mL SEA或SEB(浓度1 mg/L),隔天注射,共7次。其它小组注射相同剂量生理盐水对照。BALB/c小鼠出生后4周建立哮喘模型,实验组和模型组分别在0、7和14 d用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏,在28 d开始隔天OVA雾化激发哮喘,共7次,末次激发后24-48 h内取支气管肺泡灌洗液(BALF),进行嗜酸性粒细胞和总白细胞计数,其余BALF离心-70℃冻存检测细胞因子,固定肺组织做病理切片分析。结果:SEA组和SEB组小鼠肺组织炎症反应轻于模型组,BALF中嗜酸性粒细胞数量少于模型组(P<0.05);SEA、SEB组BALF中Th1细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)高于模型组(P<0.05);而Th2细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)和嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)均低于模型组(P<0.01)。结论:早期感染SEA、SEB可以减少小鼠慢性哮喘支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量,可能通过调节Th1/Th2细胞因子比值减轻气道中的哮喘炎症反应。

金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系的建立及应用

目的建立SYBR-Green荧光PCR体系金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系,应用于金黄色葡萄球菌食物中毒和食品风险监测快速诊断。方法根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E基因的保守序列设计特异性引物,分别建立SYBR-Green荧光PCR体系。应用该系列体系检测185株金黄色葡萄球菌野生株的肠毒素基因A～E型。结果建立的SYBR-Green荧光PCR系列体系其DNA灵敏度为1.34～2.80ng/μL,菌液灵敏度为46～96CFU/mL;用以检测185株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因A～E型,携带一种基因型的为58.38%,同时携带两种以上毒素基因占4.86%。结论建立的荧光PCR反应体系快速、灵敏度高、特异性强,能应用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因的准确分型,对食物中毒诊断和食品风险监测很有意义。

金葡菌肠毒素B在烫伤脓毒症大鼠早期肠损害中的作用及意义

目的 :探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)在烫伤脓毒症大鼠早期肠损害中的作用。方法 :雄性Wis tar大鼠 86只 ,随机分为正常对照组 (n =10 )、烫伤对照组 (n =10 )、烫伤后金葡菌感染组 (n =5 0 )和SEB单克隆抗体(单抗 )拮抗组 (n =16 )。留取血样品测定SEB、内毒素、肿瘤坏死因子 -α (TNF -α)和干扰素 -γ(IFN -γ)水平 ;同时测定组织内毒素水平及小肠组织二胺氧化酶 (DAO)活性。结果 :烫伤后金葡菌感染动物血浆SEB、TNF -α和IFN -γ水平均显著高于正常对照组 ,并于 2h、6h达峰值 (P <0 0 5或P <0 0 1) ,此后降低 ;而小肠组织DAO活性则持续低于对照组 (P <0 0 5 )。相关分析显示 ,小肠组织DAO活性与血浆SEB水平呈显著负相关 (r =- 0 4398,P <0 0 5 )。此外 ,金葡菌攻击后动物血浆及心、肝、肺、肾等组织中内毒素含量亦明显高于正常和烫伤对照组水平 (P <0 0 5 ) ;SEB单抗干预可不同程度抑制血浆及组织内毒素水平的变化 ,其中伤后 2h肾脏改变显著 (P <0 0 5 )。结论 :在严重烫伤后金葡菌感染时 ,金葡菌的重要致病因子 -SEB可加重动物小肠粘膜屏障功能损害 ,促进肠源性内毒素移位并蓄积于局部组织 ,后者可能与金葡菌致病因子协同作用导致脓毒症的病理生理过程进一步恶化。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2中缺口的形成及影响因素的研究

目的：探索影响金黄色葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）断裂的因素。方法：将纯化的肠毒素在不同条件下处理,观察环境因素对其断裂程度的影响。结果：重组SEC2断裂的位置可能位于其分子93位半胱氨酸与110位半胱氨酸之间。重组SEC2在37℃下、24 h内会完全产生断裂,在碱性条件下则加速其断裂的形成;H2O2会导致重组SEC2产生非特异性降解。当溶液中有β-巯基乙醇（2%）、苯甲基磺酰胺（5-10 mmol/L）、咪唑（1 mol/L）或大肠杆菌粗提物时,重组SEC2的断裂可被有效抑制。结论：肠毒素C2容易在特定位点发生断裂,可能与蛋白质本身结构有关。

超抗原葡萄球菌肠毒素B诱导的小鼠髓质区CD4SP胸腺细胞各亚群的克隆清除

目的：利用北京大学基础医学院免疫学系T细胞室建立的小鼠髓质区CIM单阳性（single positive，SP）胸腺细胞的发育程序，观察超抗原葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxinB，SEB）对髓质区CIMSP胸腺细胞各亚群的克隆清除情况，从而了解胸腺细胞阴性选择的阶段特异性。方法：从尾静脉注射SEB后，检测小鼠胸腺细胞表面分子的表达及凋亡情况，并根据细胞计数计算髓质区CIMSP胸腺细胞各亚群的减少情况。结果：注射SEB后，胸腺细胞凋亡明显增加，CIMSP细胞数减少显著，约减少了43．8％。进一步分析T细胞受体（Tcellreceptor，TCR）Vβ8^＋CD4^＋细胞后发现，6C10^＋CD69^＋Qa-2^-的细胞（SP1）的比例减少了近2／3，而Qa-2^＋的细胞（SP4）比例相对增加。计算TCR Vβ8^＋CD4^＋细胞各亚群的绝对细胞数，结果发现，SP1、SP2、SP3均减少80％以上，而SP4减少50％左右。结论：胸腺阴性选择发生在SP阶段，并贯穿SP胸腺细胞的整个发育过程，而处于发育成熟阶段的SP4细胞对凋亡较不成熟的SP1～SP3耐受。

PCR检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因谱携带情况,探讨与食物中毒发病相关的金黄色葡萄球菌基因类型。方法:取食品中检出的金黄色葡萄球菌进行分离培养鉴定,通过PCR技术检测样本18种不同型的肠毒素基因的携带情况,并进行统计学分析。结果:食品中检出的金黄色葡萄球菌肠毒素基因有较高的阳性检出率,主要检出sea、seb、sei、seg、sel、sem、sen等基因,其中sea基因检出率最高,达到77.27%;sei、seg、sem、sen基因具有相关性,检出率为9.09%;seb、sel基因的检出率为4.55%。结论:在食品中主要检出金黄色葡萄球菌肠毒素sea、sei、seg、sem、sen、seb、sel等基因,其中,sei、seg、sem、sen基因的相关性还有待进一步深入研究。

金黄色葡萄球菌类肠毒素K对T淋巴细胞活化特点及抗肿瘤活性研究

目的:探究金黄色葡萄球菌类肠毒素K(SElK)对T淋巴细胞活化的影响,分析其体内外抗肿瘤活性,为进一步研究SElK生物学活性提供理论基础与技术保障,促进SElK在临床肿瘤治疗中的应用。方法:流式细胞术检测SElK刺激小鼠脾CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞增殖及对脾淋巴细胞凋亡的影响;qPCR检测经SElK刺激48 h后小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ、颗粒酶A和B基因表达,以及SElK刺激后人外周血单核细胞(PBMCs)中具有特异性TCR Vβ的T淋巴细胞增殖谱变化;MTT法检测SElK激活的人PBMCs对人乳腺癌肿瘤BT474细胞及人肺癌A431细胞增殖的影响;成功制备小鼠肿瘤模型后,尾静脉注射SElK,实验结束时处死小鼠,分离肿瘤组织,检测肿瘤抑制效果。结果:SElK刺激后可显著提高小鼠脾CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞百分比,有效降低脾淋巴细胞凋亡率,显著提高小鼠脾淋巴细胞IFN-γ、颗粒酶A和B基因表达,显著激活携带TCR Vβ5、17和20的人T淋巴细胞,尤其是携带TCR Vβ5的人T淋巴细胞;SElK在体内外均表现出明显的抗肿瘤活性。结论:SElK可通过活化T淋巴细胞促进细胞因子分泌,进而发挥其抗肿瘤活性。

鼻窦源性葡萄球菌肠毒素B在溃疡性结肠炎发病中的作用

目的研究鼻窦源性葡萄球菌肠毒素B在溃疡性结肠炎发病中的作用.方法选择32例同时患有慢性鼻窦炎和溃疡性结肠炎病例,另选10例没有患慢性鼻窦炎的溃疡性结肠炎病人作为对照,20例健康志愿者作正常对照组,所有病例进行病变程度计分(0～4分,0分为无症状,4分为疾病严重).回收上颌窦冲洗液,进行鼻内镜手术,做血清葡萄球菌肠毒素B特异性IgE、IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ含量测定.结果经鼻内镜治疗后临床症状显著改善,29/32(90.6%)的病例慢性鼻窦炎临床症状计分降至0或1,21/32(65.6%)病例的溃疡性结肠炎临床症状计分为0或1,鼻内镜手术后Th1/Th2失平衡状态逆转,血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ含量均接近正常对照组(P＜0.05).术前上颌窦冲洗液中均检测到较高浓度的葡萄球菌肠毒素B[(154.6±18.6) pg/ml],血清中也检测到葡萄球菌肠毒素B特异性抗体,术后上颌窦冲洗液中葡萄球菌肠毒素B和血清抗葡萄球菌肠毒素B抗体含量比术前显著降低(P＜0.05).结论鼻窦源性葡萄球菌肠毒素B可能是溃疡性结肠炎的发病原因之一.

重组超抗原葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及表达载体的构建

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)全长基因并构建其表达载体。方法 以金黄色葡萄球菌的基因组 DNA为模板 ,用两条针对 SEA全长基因特异的引物 ,通过 PCR方法克隆 SEA全长基因 ,PCR产物与p GEM- T载体连接 ,经测序证实后进行亚克隆 ,构建其表达载体 p ET- 2 8b- SEA,再次测序验证。结果 克隆了 SEA全长基因 ,编码 2 5 7个氨基酸残基 ,经测序证实与 Genbank中收录的 SEA基因序列完全一致 ;并构建了 SEA的表达载体。结论 成功克隆了 SEA全长基因并构建了其表达载体 ,为进一步研究

低气道超敏反应中鼻源性葡萄球菌肠毒素B对Th2细胞的影响

目的探讨由葡萄球菌肠毒素B(SEB)在慢性鼻炎鼻窦炎(CRS)和哮喘之间联系的作用,并确定来源于CRS的SEB在哮喘发病机制中的作用。方法38例同时患CRS和哮喘病的病人,行鼻内镜手术外科治疗,手术后分别对血清中特异性IgE和细胞因子进行检测,并对CRS和哮喘病的临床症状进行评估,分离培养外周血单核细胞(PBMCs),存在或不存在特异性抗原和SEB的情况下,于培养的PBMCs中观察Th2反应。对照组包括:25例仅患CRS的病人,23例仅患哮喘的病人,20例健康对照。结果鼻窦手术后,同时患CRS和哮喘的病人的临床症状和肺功能有所改善,对照组为单独患CRS病人的临床症状改善。术后细胞因子、IL-4、IL-5较术前明显降低,对照组术前、术后没有明显变化。受特异性抗原刺激,培养的PBMCs产生Th2反应,而SEB在维持Th2反应所必需。对照组没有产生Th2反应。结论与鼻窦炎有关的低气道超敏反应中,细菌超抗原SEB在维持Th2反应过程中起了关键作用。

致病性小肠结肠炎耶尔森菌耐热肠毒素多重PCR鉴定

目的对致病性小肠结肠炎耶尔森菌产生的耐热肠毒素用多重PCR方法进行鉴定、分析,开展病原微生物基因诊断。方法根据GenBank中致病性耶尔森菌耐热肠毒素基因序列,设计出针对Y-STa、Y-STb、Y-STc毒素基因的3对特异引物,运用多重PCR方法鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森菌产生的耐热肠毒素。结果运用多重PCR扩增出预先设计的3条特异的目的条带。结论所设计的多重PCR反应体系能够得到致病性小肠结肠炎耶尔森菌耐热肠毒素的特异序列,同时能够对3种毒素基因序列进行鉴定分型。

重组轮状病毒肠毒素NSP4肽段aa112-175的免疫佐剂活性研究

目的确定并评价大肠杆菌中重组表达的轮状病毒肠毒素NSP4肽段aa112-175的免疫佐剂活性,并与商品化的铝佐剂进行比较。方法以葛兰素史克公司生产的2011-2012季节性流感病毒裂解疫苗福禄立适(Fluarix)为抗原,通过小鼠平行免疫实验,检测经纯化后冻干的重组肽段aa112-175、铝佐剂的佐剂活性。得到了初次免疫后3周,小鼠Fluarix特异的Ig G水平,以及加强免疫后2周,小鼠Fluarix特异的Ig G水平和IFN-γ水平数据,进而比较两种佐剂的活性,判定重组轮状病毒NSP4肽段aa112-175的佐剂活性水平。结果轮状病毒肠毒素NSP4肽段aa112-175在大肠杆菌中获得分泌表达,初次免疫和加强免疫后,NSP4 aa112-175佐剂的血清特异Ig G水平与铝佐剂组相当,特异的IFN-γ水平约为铝佐剂组的2倍。结论轮状病毒肠毒素NSP4重组肽段aa112-175经肌肉注射免疫小鼠后,其加强流感疫苗的体液免疫反应的佐剂活性与铝佐剂相似,细胞免疫反应强于铝佐剂。

金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备稳定分泌抗金黄色葡萄球菌肠毒素(SEI)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的性质进行鉴定。方法:以SEI蛋白免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,经ELISA检测筛选及3次有限稀释,获得目的杂交瘤细胞株;采用杂交瘤细胞免疫小鼠,制备并纯化了单克隆抗体,并对所获得的单克隆抗体进行性质鉴定。结果:最终获得了两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞8F7与D8,两者分别为IgG2b型与IgG1型;亲和常数分别为9.215×108L.mol-1和1.968×1010L.mol-1;两者均有较强的特异性,与纯化的SEG、SEE、SEC及金黄色葡萄球菌上清液均未有交叉反应;相加实验表明两个单克隆抗体识别的为相同表位。结论:单克隆抗体的成功制备,为初步建立肠毒素SEI的双抗夹心测定方法奠定了基础。

慢性鼻-鼻窦炎中金黄色葡萄球菌肠毒素基因研究

目的检测国人慢性鼻-鼻窦炎患者鼻腔金黄色葡萄球菌肠毒素基因谱,探讨与国人慢性鼻-鼻窦炎发病相关的金黄色葡萄球菌肠毒素基因类型。方法本实验取国人慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉组、慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉组及鼻中隔偏曲组患者中鼻道黏膜拭子进行金黄色葡萄球菌分离培养鉴定,通过PCR技术检测实验组每例患者金黄色葡萄球菌样本18种肠毒素基因的携带情况,并进行统计学分析。结果 3组患者金黄色葡萄球菌肠毒素基因均有较高的阳性检出率,但差异无统计学意义;3组患者阳性检出例数均较高的几种肠毒素基因为:seg、sem、sen、sei、seo、seu;金黄色葡萄球菌肠毒素基因seq在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者中有16例阳性检出,而对照组无阳性检出,差异有统计学意义。结论金黄色葡萄球菌肠毒素seg、sem、sen、sei、seo、seu可能在慢性鼻-鼻窦炎的发病中起主要作用,肠毒素seq与慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉发病的关系还有待进一步深入研究。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对活化T细胞端粒长度影响及其相关机制研究

目的:研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对T细胞端粒长度的作用及机制。方法:SEA、K562细胞、SEA联合K562细胞以及抗CD3单克隆抗体分别刺激脐带血单核细胞,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测端粒、hTERT及IL-7R表达。结果:SEA组、K562细胞组、SEA联合K562细胞组及抗CD3单抗组活化T细胞的端粒相对长度比值为1.63±0.08、1.06±0.06、3.24±0.61、1.37±0.07;hTERT的表达差异倍数为1.88±0.07、1.95±0.05、3.93±0.23、1.30±0.06;IL-7R表达差异倍数为6.61±0.52、12.81±0.34、17.42±0.50、4.87±0.66;SEA联合K562细胞组均明显高于其他3组(P<0.01),SEA组对端粒长度影响大于单纯K562细胞组。结论:超抗原SEA可以直接刺激T细胞的端粒酶活性及上调表达IL-7R,联合特异性抗原K562细胞株诱导T细胞活化上调效果更明显。

密码子优化提高重组金葡菌肠毒素O在大肠杆菌中的表达水平

目的:优化稀有密码子提高重组肠毒素O的表达量。方法:将带H is标签的肠毒素O成熟肽克隆至pET28a质粒上,采用PCR方法对15个稀有密码子进行突变,将突变后的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),并进行蛋白表达及活性鉴定。结果:通过稀有密码子优化,重组肠毒素O的表达量由菌液总蛋白的7.49%提高至19.8%;小鼠淋巴细胞增殖试验表明,通过密码子优化的肠毒素O具有刺激淋巴细胞增殖的作用,并且其增殖作用与未优化前的肠毒素O相当。结论:稀有密码子优化能够有效增加肠毒素O的表达量。